ウエルシュ菌エンテロトキシン受容体の分子クローニング

产气荚膜梭菌肠毒素受体的分子克隆

• 批准号: 07770195
• 负责人: 片平 じゅん
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770195/
• 关键词: ウエルシュ菌; エンテロトキシン; 受容体; 発現クローニング

1.エンテロトキシン感受性細胞と非感受性細胞を用いたサブトラクションライブラリーの作成当初、スクリーニングを容易にするためサブトラクションライブラリーを作成する予定であったが、より多くのクローンを短時間にスクリーニングする方法を開発したので(下記参照)、感受性細胞であるVero細胞より抽出したpolyA RNAよりcDNAを合成し、真核細胞発現用プラスミドpMEsf(-)pyoriへ挿入し、通常のライブラリーを作成した。2.エンテロトキシン受容体のクローニング短時間でより多くのクローンをスクリーニングするために、セルソーターを用いたエンテロトキシン受容体発現細胞の検出法の確立を試みた。ビオチン標識エンテロトキシンC末端フラグメント(大腸菌で発現し精製)をプローブとして用い、フィコエリスリン(PE)標識アビジンを用いて、エンテロトキシンC末端フラグメントの数種類の培養細胞表面への結合を検討した。その結果、既報のとおり感受性細胞(Vero細胞、Hela細胞)へのC末端フラグメントの結合がPE標識アビジンの細胞表面への結合による蛍光強度の増加として認められた。一方、非感受性細胞(L929細胞、K562細胞)への結合は認められなかった。以上の結果このスクリーニング法により、上記1.で作成したライブラリーのスクリーニングが可能であることが示唆された。この方法では、約8時間で1000万クローンのスクリーニングが可能である。現在、L929細胞へライブラリーをトランスフェクトし、スクリーニングを行っている。3.エンテロトキシン受容体の性状の解析陽性クローンが得られ次第、各クローンの塩基配列の決定、細胞内での局在部位の同定、エンテロトキシンとの結合能の解析等、エンテロトキシン受容体の性状解析を行う予定である。

1.使用肠毒素敏感和非敏感细胞创建消减文库最初，我们计划创建一个消减文库以方便筛选，但我们开发了一种在更短的时间内筛选更多克隆的方法，因此，从polyA合成cDNA。从易感细胞 Vero 细胞中提取 RNA，插入真核细胞表达质粒 pMEsf(-)pyori 中，构建常规文库。 2.肠毒素受体的克隆为了在短时间内筛选尽可能多的克隆，我们尝试建立一种使用细胞分选仪检测肠毒素受体表达细胞的方法。使用生物素标记的肠毒素C端片段（在大肠杆菌中表达和纯化）作为探针和藻红蛋白（PE）标记的亲和素，研究了肠毒素C端片段与几种类型的培养细胞表面的结合。结果，如之前报道的，由于 PE 标记的亲和素与细胞表面的结合，观察到 C 末端片段与敏感细胞（Vero 细胞、Hela 细胞）的结合，荧光强度增加。另一方面，没有观察到与非敏感细胞（L929细胞、K562细胞）的结合。上述结果表明，使用该筛选方法，可以筛选上述1.中创建的文库。这种方法可以在大约 8 小时内筛选 1000 万个克隆。目前，我们正在将该文库转染至L929细胞中并进行筛选。 3.肠毒素受体的特性分析一旦获得阳性克隆，我们就通过确定每个克隆的碱基序列、识别细胞内的定位位点以及分析与肠毒素结合的能力来分析肠毒素受体的特性。这样做。