培養中枢神経細胞におけるaSセリン129リン酸化キナーゼの解析

培养中枢神经细胞中 aS 丝氨酸 129 磷酸化激酶的分析

基本信息

批准号：
07J52144
负责人：
原進
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Yamagata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J52144/
关键词：
脳神経疾患神経科学

项目摘要

パーキンソン病(PD)は、中年以降に発症する神経変性疾患である。PD全体の90-95%は、明らかな遺伝を示さない孤発性PD(sPD)である。精力的な研究が行われているが、sPDの発症機構の詳細は解明されていない。sPDを病理学的・生化学的に特徴づけるレビー小体(LB)の主要構成成分α-シヌクレイン(αS)は、種々の翻訳後修飾を受ける。LBでは、大部分のαSの129番目のセリン残基がリン酸化されていることが明らかになっている。αSセリン129のリン酸化は、αSの重合化及び細胞毒性の発揮に重要な働きを担っていることが、in vitroとin vivoの解析より示されている。このリン酸化反応を司る候補キナーゼとして、カゼインキナーゼIとII、Gタンパク質共役型受容体キナーゼ(GRK)ファミリーのGRK2とGRK5が知られている。しかし、GRKファミリー分子がとの程度αSセリン129のリン酸化に寄与しているのか不明である。本研究は、種々の細胞で発現が確認されているGRKファミリー(GRK2,3,5,6)に焦点を当て、内因性レベルでこれらキナーゼのαSセリン129リン酸化反応に対する寄与を検討した。方法として、野生型αSを安定的に発現したヒト胎児腎細胞由来のHEK293細胞及びヒト神経芽細胞腫由来のSH-SY5Y細胞において、RNA干渉法を用いてGRKファミリー分子の発現を抑制し、αSセリン129のリン酸化反応の変化の有無を検索した。HEK293細胞において、各GRK分子に対する合成siRNAのトランスフェクションにより、コントロールsiRNAをトランスフェクションした場合に比べ、90%以上の標的分子の発現抑制を認めた。この発現抑制下で、各GRK分子の効果を比べると、αSセリン129のリン酸化反応は、GRK3及びGRK6の発現抑制によって有意な減少を示していた。SH-SY5Y細胞では、siRNAのトランスフェクションによって、各GRK分子は50%以上発現抑制された。この条件において、αSセリン129リン酸化反応は、GRK3、GRK5、さらにGRK6の発現抑制によって有意に減少していた。この結果から、培養細胞間でαSセリン129のリン酸化反応に寄与するGRK分子に違いがあること、神経系培養細胞では、GRK3、GRK5、GRK6が内因性レベルでαSセリン129のリン酸化反応に寄与していることが示唆された。今後、各キナーゼの寄与を明確にすることはsPDの治療標的として神経細胞死を抑制するαSのリン酸化阻害剤の開発に重要な知見を与えると考えられる。本研究成果は、神経科学の国際学会である「Society for Neuroscince2007」で発表した。

帕金森氏病（PD）是一种神经退行性疾病，在中年及以后发展。所有PD的90-95％是散发性PDS（SPD），这些PDS（SPD）并未显示出明显的继承。尽管已经进行了精力研究，但尚未阐明SPD发展机制的细节。在病理和生物化学上表征SPDα-突触核蛋白（αs）的Lewy体（LB）的主要成分，经过了多种翻译后修饰。在LB中，已经表明，大多数αs位置的丝氨酸残基是磷酸化的。体外和体内分析表明，αs丝氨酸129的磷酸化在αs的聚合和施用细胞毒性中起重要作用。酪蛋白激酶I和II和GRK2和GRK5是G蛋白偶联受体激酶（GRK）家族，被称为候选激酶，负责这种磷酸化反应。但是，尚不清楚GRK家族分子是否有助于αs丝氨酸129相对于该程度的磷酸化。这项研究的重点是GRK家族（GRK2、3、5、6），其表达已在各种细胞中得到证实，并检查了这些激酶对内源水平上αS丝氨酸129磷酸化反应的贡献。作为一种方法，GRK家族分子的表达被抑制在人类胚胎肾细胞中的HEK293细胞中，这些细胞稳定地表达了来自人类神经母细胞瘤的野生型αs和SH-SY5Y细胞，是RNA神经瘤的RNA干扰素，是搜索αSSern sirn sirn sirn sirn shek293的磷酸化反应的变化，以搜索Hek293的磷酸化反应。与对照siRNA转染时，抑制了超过90％的靶分子的表达。在这种表达抑制下，当比较每个GRK分子的作用时，通过抑制GRK3和GRK6的表达，αs丝氨酸129的磷酸化反应显着降低。在SH-SY5Y细胞中，siRNA转染抑制了每个GRK分子的表达> 50％。在这些条件下，通过抑制GRK3，GRK5甚至GRK6的表达，αS丝氨酸129磷酸化反应显着降低。这些结果表明，培养细胞之间αs丝氨酸129的GRK分子有差异，而在培养的细胞中，GRK3，GRK5和GRK6在内源水平上有助于αS丝氨酸129的磷酸化。将来，阐明每种激酶的贡献将为抑制神经元细胞死亡作为SPD的治疗靶点的αs的磷酸化抑制剂的发展提供重要的见解。这项研究发现是在神经科学国际神经科学会议上的神经科学会上提出的。