遺伝子改変マウスを用いた血管新生におけるTGF-βシグナル系の解析

使用转基因小鼠分析血管生成中的 TGF-β 信号系统

基本信息

批准号：
07J45111
负责人：
伊東史子
金额：
$ 1.41万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J45111/
关键词：
TGF-β 血管新生遺伝子改変マウス ALK5 Smad

项目摘要

血管新生におけるTGF-β/ALK1シグナルの重要性を明らかにするために、TGF-β/ALK5シグナルを欠失しているがALK1シグナルは維持できる変異型ALK5ノックイン(KI)マウスを作成した。しかし、ALK5KIマウスホモ接合体の表現型はALK5KOマウスと非常に良く似た表現形を示した。これは、ALK5シグナルが欠陥平滑筋細胞を含む全身で欠損させた影響が強かったと推測される。そこで血管内皮細胞特異的にTGF-β/ALK5シグナルを遮断する目的で、細胞内シグナル伝達分子であるSmad2/3を血管内皮細胞特異的に欠損させた(Smad2^<F/F>;Smad3^<-/->;Tie2-Creコンディショナルダブル欠損(Smad2/3CDKO))マウスを作製した。Smad2/3CDKOマウスはこれまで報告されたTGF-βシグナル関連分子欠損マウスと異なり、初期の血管新生には異常が見られなかった。ところが、胎生11.5日に脳内及び神経管内に出血し、胎生12.5日に致死となった。出血の原因としてタイトジャンクションを形成するClaudin5の発現やVSMCの血管へのリクルートが減少していることが免疫染色及び電子顕微鏡による解析により明らかとなった(投稿準備中、平成20年血管生物医学会YIA受賞)。ECだけでTGF-βシグナルを欠損させても、VSMCの血管へのリクルートが低下するという現象のほかに、TGF-βシグナルがECの成熟にも関与していることが示された。つまりTGF-βは血管新生を促進または抑制しているのではなく、促進または成熟化へと導くことが初めて示された。血管内皮細胞におけるId1の役割を明らかにするために、Yeast two hybrid法を用いて結合タンパクを同定し、その中で特に強く結合しているタンパク質E2-2について解析を行った。その結果、E2-2はId1に結合して作用を抑制し、血管新生を負へと調節していることが明らかとなった。

为了阐明 TGF-β/ALK1 信号在血管生成中的重要性，我们培育了突变型 ALK5 敲入 (KI) 小鼠，其缺乏 TGF-β/ALK5 信号但保留 ALK1 信号。然而，纯合 ALK5KI 小鼠的表型与 ALK5KO 小鼠非常相似。这可能是由于全身 ALK5 信号丢失的强烈影响，包括有缺陷的平滑肌细胞。因此，为了特异性阻断血管内皮细胞中的TGF-β/ALK5信号，我们特异地删除了血管内皮细胞中的细胞内信号分子Smad2/3（Smad2^<F/F>;Smad3^</-/-> ；生成Tie2-Cre条件双缺陷(Smad2/3CDKO))小鼠。与之前报道的缺乏TGF-β信号相关分子的小鼠不同，Smad2/3CDKO小鼠在早期血管生成中没有表现出异常。然而，在胚胎第11.5天，大脑和神经管发生出血，患者在胚胎第12.5天死亡。免疫染色和电子显微镜分析显示，形成紧密连接的Claudin5的表达以及VSMC向血管的募集减少是出血的原因（准备提交，2008年血管生物医学学会YIA奖）。即使仅在 EC 中删除 TGF-β 信号传导，VSMC 向血管的募集也会减少，此外，TGF-β 信号传导也被证明参与 EC 的成熟。换句话说，首次证明TGF-β不促进或抑制血管生成，而是促进或导致其成熟。为了阐明 Id1 在血管内皮细胞中的作用，我们使用酵母二杂交方法鉴定了结合蛋白，并分析了结合特别强的蛋白 E2-2。结果表明，E2-2 与 Id1 结合并抑制其作用，从而负向调节血管生成。