振動分光法による生体超分子中のアミノ酸残基の機能解析

利用振动光谱法对生物超分子中的氨基酸残基进行功能分析

基本信息

批准号：
07J10787
负责人：
柳澤幸子
金额：
$ 2.18万
依托单位：
University of Hyogo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J10787/
关键词：
トリプトファン代謝インドールアミン2,3ジオキシゲナーゼチトクロム酸化酵素ミトコンドリア生エルギー変化プロトンポンプ振動分光法時間分解共鳴ラマン分光法チトクロムc酸化酵素生体エネルギー変換膜タンパク質酸化的リン酸化

项目摘要

インドールアミン2,3ジオキシゲナーゼ(IDO)は、ヘム含有二原子酸素添加酵素で、ヒトにおける主なトリプトファン代謝経路の最初の反応を触媒する。近年、免疫系の病気への関わりが明らかになる一方で、酵素反応における反応機構そのものは不明である。医学および薬学の観点からも反応機構の解明が待たれる状況において、昨年度に引き続き反応中間体の検出を目指してラマン分光測定を行なった。昨年度は、共鳴ラマン分光法を用い、反応中間体を検出する事に成功した。1つは酸素化型で、もう1つはこれまで想定されていなかったオキソ型である。これは酵素反応が比較的遅い条件においてであった。そこで本年度はオキソ型反応中間体が、酵素反応が速い条件下であっても存在する事を確かめた。また、時間分解共鳴ラマン分光法を用い、基質存在下三者複合体の検出に成功した。本酵素には基質阻害、すなわち、ある濃度以上の基質濃度では反応速度が遅くなる性質がある。時間分解共鳴ラマン分光測定において、基質阻害がある条件と無い条件の両方について三者複合体の検出に成功した。その結果、これら2条件で鉄と酸素の結合に由来するラマンバンドは一致しており、基質阻害の有無が三者複合体形成時の中心金属と酸素分子の結合に違いを与えないことを明らかにした。ミトコンドリアの呼吸鎖電子伝達系末端において、酸素を水にまで還元するとともにプロトンを内膜の内側から外側へとポンプするチトクロム酸化酵素を、人工リン脂質二重膜に再構成したCOVについての共鳴ラマン分光測定系を昨年度において作成した。しかし、膜電位が本酵素の機能発現に与える影響を調べるためには、より良質で共鳴ラマンスペクトル測定に必要な量のCOVを常に得られる調製法を確立する必要があった。そこで本年度は、ラマンスペクトル測定を行なっても膜に損傷を受けないCOVをこれまでの10倍量程度得る調製法を確立した。

吲哚胺2,3二氧酶（IDO）是一种含血红素的双氨基氧酶，可催化人类主要色氨酸代谢途径的初始反应。尽管近年来已经阐明了免疫系统与疾病的参与，但酶反应中反应的机理本身尚不清楚。在等待从医学和药物的角度阐明反应机制的情况下，进行了拉曼光谱法以帮助检测反应中间体，就像上一个财政年度一样。去年，我们使用共振拉曼光谱法成功地检测了反应中间体。一种是一种氧化形式，另一种是以前尚未预期的氧化型。这是在酶反应相对较慢的条件下。因此，今年我们证实，即使在酶反应快速的条件下，氧型反应中间体也存在。此外，使用时间分辨的共振拉曼光谱法在存在底物的情况下成功检测三方复合物。该酶具有抑制底物的特性，即在高于一定浓度的底物浓度下，反应速率会减慢。在时间分辨的共振拉曼光谱中，在两种情况下有和没有底物抑制的条件下，对三方复合物的检测均成功。结果，可以揭示在这两种条件下从铁和氧之间衍生的拉曼带，并且在三方络合物形成期间，中央金属与氧分子之间的键之间存在或不存在底物抑制作用。去年，我们为COV创建了一个共振拉曼光谱系统，其中将氧化物氧化酶从内部和内膜内部和外部降低到水中，并从内部和外部泵泵，并在呼吸链链链链链链链链链链链链链链链链链末期末端的末端和人工磷脂双层均已重构。但是，为了研究膜电位对该酶功能表达的影响，有必要建立一种制备方法，该方法将不断获得测量共振拉曼光谱所需的COV量。因此，今年我们建立了一种制备方法，该方法允许即使通过拉曼光谱测量，也不会损坏膜的COV量的10倍。