部位特異的変異導入によるサーモライシンの機能改変とペプチド合成への応用

通过定点诱变对嗜热菌蛋白酶进行功能修饰及其在肽合成中的应用

基本信息

批准号：
07J07098
负责人：
草野正雪
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでの報告から,サーモライシン(TLN)の活性を向上させる変異はLeu144→Ser(A1),Asp150→Glu(A2),Ile168→Ala(A3)であり,熱安定性を向上させる変異はSer53→Asp(S1),Leu155→Ala(S2),Gly8→Cys/Asn60→Cys/Ser65→Pro(S3)である.これらの変異の組合わせによる活性と熱安定性への効果を調べた。その結果,活性を向上させる変異であるA1とA2を組合わせたとき活性が最も向上した[N-carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester(ZDFM)加水分解のkcat/kmは野生型酵素の10.5倍].一方,A1とA3を組合わせると活性が消失した。熱安定性を向上させる変異であるS1とS2を組合わせたとき熱安定性が最も向上した[80℃で熱失活の一次反応速度定数(kobs)は野生型酵素の10%].一方,S1とS3を組合わせると熱安定性が向上しなかった。さらに,A1,A2,S1を組合わせると活性と熱安定性がともに向上した(ZDFM加水分解のkcat/kmは野生型酵素の10.2倍,kobsは野生型酵素の60%).すなわち,変異の組合わせにより,活性と熱安定性がともに向上した変異型TLN(L144S/D150E/S53D)が取得された。一方,A1,A2,S1,S2,あるいはA1,A2,S2を組合わせると活性が消失した。A1とS2の組合わせは活性を消失させることが示唆された。また,TLNは加水分解の逆反応を利用して人工甘味剤アスパルテームの前駆体であるZDFMの合成に応用されてきた.活性が向上した変異型酵素によるZDFM合成反応を解析した.その結果,これらの変異型TLNは野生型酵素よりもZDFM合成反応を効率的に進めることができると考えられた。

先前的报道表明，改善热溶酶（TLN）活性的突变是LEU144→SER（A1），ASP150→GLU（A2），ILE168→ALA（A3），以及改善热溶酶素活性的突变是SER53→ASP（S1），LEU1555555555→ALA（S2）（SC） Gly8→CYS/ASN60→CYS/SER65→PRO（S3）。研究了这些突变对活动和热稳定性的影响。结果，当将A1和A2合并时，该活性得到了最大的改善，即改善活性的突变是合并的[N-甲基苯并氧基-L-甲氧基-l-甲基-l-苯丙氨酸甲酯甲酯（ZDFM）水解的KCAT/km，是野生型Enzyme的10.5倍。另一方面，当A1和A3合并时，活动丢失了。当组合改善热稳定性的突变S1和S2时，热稳定性最大[主要反应速率常数（KOB）是80°C时野生型酶的10％。此外，当A1，A2和S1合并时，活性和热稳定性都得到改善（ZDFM水解的KCAT/KM是野生型酶的10.2倍，而KOBS为野生型酶的60％）。也就是说，突变体TLN（L144S/D150E/S53D）通过合并突变提高了活性和热稳定性。另一方面，当组合A1，A2，S1，S2或A1，A2，S2时，活动消失了。有人提出，A1和S2的组合将废除活性。此外，使用水解的反应反应，TLN已应用于ZDFM的合成，ZDFM是人造甜味剂阿斯巴甜的前体。我们分析了具有改善活性的突变酶的ZDFM合成反应。结果，人们认为这些突变体TLN可以比野生型酶更有效地进行ZDFM合成反应。