機能性ユビキノンプローブの合成と光親和性標識法に基づく標的膜タンパク質の解析

基于光亲和标记的功能性泛醌探针的合成及靶膜蛋白的分析

基本信息

批准号：
07J06470
负责人：
村井正俊
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

ミトコンドリアNADH-ユビキノン酸化還元酵素(複合体-I)は、ATP合成の駆動力となる自由エネルギーの約半分を生産する、呼吸鎖電子伝達系の中でも最も重要な役割を担う酵素である。ヒトでは複合体-Iの機能傷害によって生じた酸化ストレス等が原因となって、パーキンソン病などの神経変性疾患や種々のミトコンドリア病が発症することが報告されている。また、複合体-Iは合成農薬や抗寄生虫薬の有力なターゲットとしても位置づけられていることから、基礎研究のみならず応用的研究の対象としても有望である。H20年度は、前年度に引き続き、複合体-Iのユビキノン還元部位に関する情報を得るため、特異的阻害剤であるキナゾリンを鋳型とした光親和性プローブ[125I]AzQを合成し、ウシ心筋ミトコンドリアに対する光親和性標識実験を行った。各種2次元電気泳動と質量分析を組み合わせて放射能標識されたタンパク質の解析を進めた結果、[125I]AzQは複合体-Iの親水性領域の49kDaサブユニット、および膜貫通領域のND1サブユニットの両者をおよそ4:1の比率で特異的に標識することを明らかにした。[125I]AzQの主たる標識部位となった49kDaサブユニットについては、2006年に明らかになった好熱細菌(T.thermophilus)複合体-Iの部分結晶構造から、このサブユニットはプロトン輸送を司る膜貫通領域との接続部に位置し、ユビキノンの結合ポケットを構成していると考えられている。そこで、49kDaサブユニットをさらに詳細に解析した結果、Asp41-Arg63の23残基が[125I]AzQの結合部位であることを明らかにした。この領域は結晶構造から予想されていたユビキノン結合ポケットの構成領域であり、位置特異的変異によって示唆されている酵母(Y.lipolitica)複合体-Iのユビキノン還元反応に関わる重要アミノ酸をカバーする領域であった。以上のように、本研究では複合体-I阻害剤の結合部位を初めてアミノ酸レベルで明らかにし、かも阻害剤結合部位がユビキノン反応部位の近傍に存在することを証明した初めての報告である。

线粒体 NADH-泛醌氧化还原酶（复合物-I）是一种在呼吸链电子传递链中发挥最重要作用的酶，产生驱动 ATP 合成的约一半自由能。据报道，在人类中，神经退行性疾病如帕金森病和各种线粒体疾病是由于复合物-I 功能受损引起的氧化应激而发生的。 Complex-I也被认为是合成农药和抗寄生虫药物的一个有前景的靶标，使其不仅成为基础研究而且也成为应用研究的有前景的靶标。继上一年的基础上，2009年度，为了获得复合物-I的泛醌还原位点的信息，我们以特异性抑制剂喹唑啉为模板合成了光亲和探针[125I]AzQ，并将其应用于牛心脏进行了线粒体光亲和标记实验。通过结合各种二维电泳和质谱分析放射性标记的蛋白质，我们发现[125I]AzQ是复合物-I亲水区的49-kDa亚基和跨膜区的ND1亚基据透露，两者的比例约为4:1。关于49kDa亚基，它是[125I]AzQ的主要标记位点，2006年揭示的嗜热嗜热菌复合物-I的部分晶体结构表明，该亚基负责质子运输，位于与跨膜的连接处。区域并被认为构成泛醌的结合口袋。对 49kDa 亚基的更详细分析表明，Asp41-Arg63 的 23 个残基是 [125I]AzQ 的结合位点。该区域是从晶体结构预测的泛醌结合口袋的组成区域，并且是覆盖酵母（Y.lipolitica）复合物-I的泛醌还原反应中涉及的重要氨基酸的区域，这已由位置-暗示是的。如上所述，本研究首次在氨基酸水平阐明了复合物-I抑制剂的结合位点，也是首次证明复合物-I抑制剂的结合位点存在于泛醌附近的报道反应位点。