新規機能性生物発光プローブの創製とこれを用いたin vivo病態イメージング

创建一种新型功能性生物发光探针并使用它进行体内病理成像

• 批准号: 07J03749
• 负责人: 高倉 栄男
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J03749/
• 关键词: 生物発光; BRET; solvatochromism; タンパク質相互作用; in vivoイメージング; 活性酸素種; 細胞膜; avidin-biotin; 生物発光法

fireflyの発光酵素は基質特異性が高いと考えられていたため現在までのところ発光基質の骨格に全く多様性がなかった。そこで生物発光基質の骨格を様々に改変することでこれまでにない特性を持った発光基質の開発に取り掛かった。私は基質の部分構造のうちbenzothiazole骨格に着目し、この部位をquinollne、naphthalene、coumarin骨格へと改変したときの性質を精査した。その結果、coumarin骨格をもった基質の1つであるCALがこれまで報告されている発光基質の中で最も短波長の極大波長(約500nm)を示すことが明らかとなった。現在用いられている発光基質は酵素のmutantや測定条件(環境)によって発光スペクトルが変化することが知られているが、後者の性質は信頼性のある測定をする上では望ましくない。先に示したCALの蛍光特性を精査したところsolvatochromismを示さなかったため発光スペクトルの変化が起こらないことが予想された。実際に酵素のmutantを用いて性質を確認したところ、発光スペクトルの変化が起こらないことが明らかとなり、有用な性質をもった基質であることが示された。CALのこれらの特性を利用して、タンパク質相互作用を検出するために用いられているbioluminescence resonance energy transfer(BRET)の系へと応用した。従来までは波長の性質上BRETペアとして不適であった黄色蛍光タンパク質(YFP)を用いたBRET系の確立を目指した。fireflyの発光酵素とYFPを結合させたタンパク質を作製しCALを用いてアッセイを行ったところ、効率良いBRETシグナルが観測され、世界で初めてfireflyの発光酵素とYFPによるBRETに成功した。

迄今为止，发光底物的骨架上没有多样性，因为萤火虫的发光酶被认为是高度底物的。因此，通过以各种方式修改生物发光底物的骨干，我们开始开发具有前所未有特性的发光底物。我专注于底物的子结构的苯噻唑骨骼，并在将其修改为Quinollne，Naphthalene和Coumarin骨骼时检查了该站点的性质。结果，据揭示了CAL（具有香豆素骨架的底物之一）迄今为止所有发光底物的最短波长最大波长（约500 nm）。众所周知，当前使用的发光底物的发射光谱取决于酶的突变体和测量条件（环境），但是后一种特性不需要可靠的测量。在详细研究了上面所示的CAL的荧光特性之后，可以预测发射光谱不会发生任何变化，因为它没有显示出溶剂化的色素。当实际上使用突变酶确认性质时，揭示出发射光谱没有变化，表明它是具有有用特性的底物。 CAL的这些特性用于将其应用于生物发光共振能量转移（BRET）系统，该系统用于检测蛋白质相互作用。目的是使用黄色荧光蛋白（YFP）建立一个BRET系统，该蛋白（YFP）以前由于其波长性质而不适当作为BRET对。当产生一种将萤火虫的发光酶与YFP结合并使用CAL测定的蛋白质时，观察到有效的BRET信号，并使用Firefly和YFP的发光酶进行了世界上第一个成功的BRET。

项目成果

Aminoluciferin as a Highly Luminescent, Color Tunable, and Functional Substrate Scaffold of Firefly Luciferase

氨基荧光素作为萤火虫荧光素酶的高发光、颜色可调和功能性底物支架

• 发表时间: 2008
• 作者: H. Kubo;K. Matsuoka;et al.;松岡広大;松岡広大;松岡広大;Kodai Matsuoka;Kodai Matsuoka;松岡広大;松岡 広大;高倉栄男;高倉栄男;高倉栄男;高倉栄男;高倉栄男;高倉栄男;Hideo Takakura;高倉栄男;Hideo Takakura
• 通讯作者: Hideo Takakura

機能性生物発光プローブを用いた2種の酵素活性の同時検出

使用功能性生物发光探针同时检测两种酶活性

• 发表时间: 2007
• 作者: H. Kubo;K. Matsuoka;et al.;松岡広大;松岡広大;松岡広大;Kodai Matsuoka;Kodai Matsuoka;松岡広大;松岡 広大;高倉栄男;高倉栄男;高倉栄男;高倉栄男;高倉栄男;高倉栄男;Hideo Takakura;高倉栄男;Hideo Takakura;高倉 栄男;高倉栄男;高倉 栄男;Hideo Takakura;高倉 栄男
• 通讯作者: 高倉 栄男

酵素反応に適用可能な波長変化型蛍光プローブの開発

开发适用于酶反应的波长可变荧光探针

• 发表时间: 2008
• 作者: H. Kubo;K. Matsuoka;et al.;松岡広大;松岡広大;松岡広大;Kodai Matsuoka;Kodai Matsuoka;松岡広大;松岡 広大;高倉栄男;高倉栄男;高倉栄男;高倉栄男;高倉栄男;高倉栄男;Hideo Takakura;高倉栄男
• 通讯作者: 高倉栄男

Development of Functional Bioluminescence Probe Based on the Concept of Luminescence Quenching

基于发光猝灭概念的功能生物发光探针的研制

• 发表时间: 2008
• 作者: H. Kubo;K. Matsuoka;et al.;松岡広大;松岡広大;松岡広大;Kodai Matsuoka;Kodai Matsuoka;松岡広大;松岡 広大;高倉栄男;高倉栄男;高倉栄男;高倉栄男;高倉栄男;高倉栄男;Hideo Takakura
• 通讯作者: Hideo Takakura

生体応用を目指した活性酸素検出生物発光プローブの開発とその応用

生物应用活性氧检测生物发光探针的研制及其应用

• 发表时间: 2009
• 作者: H. Kubo;K. Matsuoka;et al.;松岡広大;松岡広大;松岡広大;Kodai Matsuoka;Kodai Matsuoka;松岡広大;松岡 広大;高倉栄男;高倉栄男;高倉栄男;高倉栄男
• 通讯作者: 高倉栄男