ヒト起源プロバイオティクスの腸管付着性機構の解明とその応用に関する研究

人源益生菌肠黏附机制的阐明及其应用研究

基本信息

批准号：
07J02318
负责人：
木下英樹
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

乳酸菌の有効利用のためには腸管付着メカニズムの解明が非常に重要である。これまでにヒト大腸ムチンに対し高い付着性を有するLactobacillus plantarum LA318株の付着因子グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)がABO式血液型抗原に高い付着性を示すことを明らかにした。また、GAPDH側の糖鎖認識部位を明らかにするため、NAD^+による阻害試験を行った結果、N-末端側のNAD結合ドメインが結合に関与しているのではないかと考えられた。そこで本年度では、結合部位を明らかにするためGAPDHの(1)全体、(2)N-末端側のみ、(3)C-末端側のみ、(4)C-末端側の一部欠損の4つのリコンビナント体の発現を試みた。目的のDNA断片をEscherichia coli BL-21に組み込み、トランスフォーメーションを行った。PCRにて目的断片DNAの挿入を確認後、IPTGにより発現誘導をかけ37℃、5時間培養を行ったところ、目的の位置に発現タンパク質と思われるバンドを確認できた。さらに、Ni-NTAを用いたWestern blottingによりリコンビナントタンパク質の存在を確認できた。次にリコンビナントタンパク質の発現の条件検討を行ったところ、100mM IPTG 10μL添加、37℃、5時間、200rpmでの培養が適当であると判断した。リコンビナントタンパク質は全て8M尿素画分で検出されたことから封入体を形成していると考えられた。そこで封入体画分からのHisTrap HPカラムを用いてリコンビナントタンパク質の精製を行った。今後、これらの精製リコンビナントタンパク質の酵素活性を指標としたリフォールディング確認を用い、HCMや血液型抗原に対する結合を解析し、大まかな結合部位を決定する。さらにアミノ酸置換などを行い、詳細な結合部位を特定する予定である。

阐明肠粘附机制对于乳酸菌的有效利用极其重要。我们之前已经证明，植物乳杆菌 LA318 菌株的粘附素甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) 对人结肠粘蛋白具有高粘附性，对 ABO 血型抗原也具有高粘附性。此外，为了明确GAPDH侧的糖链识别位点，我们进行了NAD^+的抑制试验，结果认为N末端侧的NAD结合结构域可能参与了绑定。因此，今年，为了明确结合位点，我们研究了四种类型的GAPDH：（1）整体，（2）仅N端，（3）仅C端，（4）部分我们尝试表达重组产物。将所需的DNA片段插入大肠杆菌BL-21中并转化。通过PCR确认目标DNA片段的插入后，用IPTG诱导表达，并在37℃培养5小时，在目标位置确认了似乎是表达蛋白质的条带。此外，通过使用Ni-NTA的蛋白质印迹证实了重组蛋白的存在。接下来，我们研究了重组蛋白的表达条件，确定加入10μL 100mM IPTG并在37℃、200rpm培养5小时是合适的。在 8M 尿素级分中检测到所有重组蛋白，表明它们形成了包涵体。因此，使用 HisTrap HP 柱从包涵体级分中纯化重组蛋白。未来，我们将通过重折叠确认，以这些纯化的重组蛋白的酶活性为指标，分析与HCM和血型抗原的结合，并确定大致的结合位点。我们计划通过氨基酸替换来进一步鉴定详细的结合位点。

项目成果

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Discavary of new probiotic lacic acid bacteria (LAB) with specific adhesion to human blood ABO type antigen of intestinal mucosa and their application

特异性粘附人血肠粘膜ABO型抗原的新型益生菌乳酸菌（LAB）的发现及其应用

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
影响因子：
0
作者：
○T. Saito;N. Wakahara;H. Kinoshita;H. Matsuo;Y. Kawai;H. Kitazawa;K. Miura;A. Horii;H. Uchida;K. Kimura;N. Taketomo
通讯作者：
N. Taketomo

乳酸菌表層グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素 (GAPDH)はヒトABO式血液型抗原構造を認識する!一乳酸菌のヒト腸管定着性機構の一部を解明-

乳酸菌表面3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）可识别人类ABO血型抗原结构！乳酸菌定植人体肠道的部分机制已被阐明。

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
影响因子：
0
作者：
木下英樹;ら
通讯作者：
ら

抗生物質代替品として有望なブタ腸管付着性新規プロバイオティック乳酸菌の探索

寻找粘附在猪肠道上的新型益生菌乳酸菌作为有前途的抗生素替代品

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
影响因子：
0
作者：
○川崎保美;木下英樹;川井泰;北澤春樹;上野啓介;小林一彦;齋藤忠夫
通讯作者：
齋藤忠夫

ブタ腸管付着性新規プロバイオティクスの探索と抗生物質低減飼料への利用(その2)

寻找可粘附在猪肠道上的新型益生菌并用于减抗生素饲料（第 2 部分）

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
影响因子：
0
作者：
○齋藤忠夫;川崎保美;木下英樹;若原望美;渡辺真通;川井泰;北澤春樹;上野啓介;小林一彦
通讯作者：
小林一彦

An assay system for probiotic lactic acid bacteria recognizing human blood type A-antigen that competitively excludes harmful intestinal bacteria

益生菌乳酸菌检测系统可识别人血 A 型抗原，竞争性排除有害肠道细菌

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
影响因子：
0
作者：
○T. Saito;N. Wakahara;H. Uchida;H. Kinoshita;Y. Kawai;H. Kitazawa;K. Miura;A. Norii;K. Kimura and N. Taketomo
通讯作者：
K. Kimura and N. Taketomo