tRNA依存アミド基転移酵素GatCABが持つアンモニアチャネルの制御機構の解明

阐明tRNA依赖性酰胺转移酶GatCAB所具有的氨通道的控制机制

基本信息

批准号：
07J01278
负责人：
中村彰良
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度,GatCAB単体の結晶化条件の最適化により,GatCAB単体の構造解析を1.9Å分解能で行うことに成功した,得られたGatCAB全長の立体構造とGatDE-tRNA^<Gln>複合体の立体構造を利用することでGatCAB-tRNA^<Gln>複合体モデルを作成した.次に作成したGatCAB-tRNA^<Gln>複合体モデルにおいて,tRNA^<Gln>の認識に関与すると予想される部位に注目し一次構造比較を行ったところ,GatBのcradle domainとC-tail domainにGatCABに特徴的な配列を見いだすことに成功した.この2つの特徴的な配列とtRNA^<Gln>認識の関係を明らかにするために,様々なGatCAB変異体を作成し,結合活性測定を行った.その結果,GatBのcradle domainに存在する3_<10>ヘリックスとC-tail domainの保存されたGlyがtRNA^<Gln>認識に重要であることが明らかになった.今年度は,変異体解析によりアンモニアチャネル制御機構の解明も目指した.活性測定は今年度作成した大腸菌in vivo活性測定系を用いた.Glu-tRNA^<Gln>を合成するND-GluRSを大腸菌で発現させると,Glu-tRNA^<Gln>は大腸菌には毒性を示すため大腸菌は生育できない.しかし,同時にGatCABを発現させると,Glu-tRNA^<Gln>はGln-tRNA^<Gln>へ変換され毒性が回避される.大腸菌in vivo活性測定系は大腸菌にND-GluRSとGatCAB変異体を共発現し,GatCAB変異体の機能が阻害されると,大腸菌の生育が遅くなることを利用して変異箇所の評価を行う.実際,活性測定を行った結果,アンモニアチャネルを制御しているゲート(E125)は立体障害でアンモニアチャネルを制御していると考えていたが,直接アンモニアの輸送に関与していることが示唆された.

去年，通过仅优化GATCAB的结晶条件，我们成功地分析了gatcab的结构分析，单独以1.9Å分辨率分析。通过利用gatcab全长结构的三维结构以及gatde-trna^<gln>复合物的三维结构，我们创建了一个gatcab-trna^<gln>复杂模型。然后，我们专注于预期参与识别tRNA^<gln>复杂模型的位点，并比较了主要结构。我们发现，GATB摇篮域和C尾我们成功地在该域中找到了GatCab的序列特征。为了阐明这两个不同的序列与tRNA^<gln>识别之间的关系，创建了各种gatcab突变体，并测量了结合活性。结果，揭示了GATB摇篮域中存在的3_ <10>螺旋和C尾域的保守gly对于tRNA^<gln>识别很重要。今年，我们还旨在通过突变分析来阐明氨气通道调节的机制。该活动是通过大肠杆菌在今年测量的。使用体内活性测量系统，当合成Glu-tRNA^<gln>的ND-Glurs在大肠杆菌中表达时，Glu-TRNA^<gln>对大肠杆菌有毒，因此大肠杆菌无法生长。但是，当gatcab同时表示时，glu-trna^<gln>转化为gln-trna^<gln>，避免毒性。体内活性测量系统中的大肠杆菌会在大肠杆菌中共表达ND-glurs和Gatcab突变体，并使用这样一个事实，即当gatcab突变体的功能被抑制时，大肠杆菌会减慢生长。实际上，活性测量表明，控制氨通道的栅极（E125）在空间上受到阻碍，负责直接氨转运。