ピリドキサミン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼの立体構造解析と機能改変

吡哆胺丙酮酸转氨酶三维结构分析及功能修饰

• 批准号: 07J00914
• 负责人: 吉金 優
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kochi University (2008)Ehime University (2007)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J00914/
• 关键词: アミノトランスフェラーゼ; ピリドキサミン; X線結晶構造解析; タンパク質工学; 機能改変; ピリドキサール; ピリドキサール5'-リン酸

近年,ピリドキサミンが糖尿病合併症の予防および治療薬として期待され,抗老化物質として,食品,化粧品分野からも注目されている.ピリドキサミンは現在化学合成されているが,環境および経済的な配慮から発酵法もしくは酵素法での生産が望ましい.そこで,酵素ピリドキサミン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ(PPAT)を利用したピリドキサールからピリドキサミンの生産系を検討してきた.本年度は,合成コストをさらに減少させるために,PPATの基質特異性をL-アラニンからより安価なL-グルタミン酸に改変することを目的とした.野生型PPATのL-グルタミン酸に対する反応性は,L-アラニンに対する反応性の1%以下であった.そこで,立体構造に基づく分子デザインやerror-prone PCRを用いたランダム変異等のタンパク質工学的手法を駆使し,PPATの基質特異性の改変を試みた.酵素活性を指標にスクリーニングを行ったところ,野生酵素のL-アラニンに対する反応性に匹敵し,大幅にL-グルタミン酸に対する親和性が増加した3重変異酵素が得られた.得られた変異酵素のL-グルタミン酸複合体の高次構造を解析したところ,変異残基がL-グルタミン酸のγ-カルボキシル基と相互作用できることが明らかとなった.得られた変異酵素を発現させた大腸菌細胞を触媒として,ピリドキサールおよびL-グルタミン酸を基質として合成反応を行ったところ,収率よくピリドキサミンを合成することでできた.以上より,ピリドキサールとL-グルタミン酸から効率よくピリドキサミンを合成することが可能となった.

近年来，吡哆胺有望成为糖尿病并发症的预防和治疗剂，并且作为抗衰老物质在食品和化妆品领域也受到关注。吡哆胺目前是化学合成的，但出于环境和经济方面的考虑，因此，需要使用吡哆胺-丙酮酸转氨酶（PPAT）来生产吡哆醛。今年，我们的目标是将PPAT的底物特异性从L-丙氨酸改为更便宜的L-谷氨酸，以进一步降低合成成本。野生型PPAT对L-谷氨酸的反应活性低于野生型PPAT的1%因此，基于三维结构的分子设计容易出错。我们尝试充分利用PCR随机突变等蛋白质工程方法来改变PPAT的底物特异性，当我们以酶活性为指标进行筛选时，我们发现其对L-丙氨酸的反应性与L-丙氨酸相当。获得了对L-谷氨酸亲和力显着增加的三重突变酶。对突变酶的L-谷氨酸复合物的高级结构的分析表明，突变残基是野生酶。 -表明，当使用表达所得突变酶的大肠杆菌细胞作为催化剂、吡哆醛和L-谷氨酸作为底物进行合成反应时，该酶可以与谷氨酸的γ-羧基相互作用。由以上可知，可以由吡哆醛和L-谷氨酸高效地合成吡哆胺。

项目成果

ピリドキシン分解酵素4-ピリドキシン酸デヒドロゲナーゼの膜トポロジー

吡哆醇降解酶4-吡哆醇酸性脱氢酶的膜拓扑

• 发表时间: 2009
• 作者: 葛飛;吉金優;八木年晴
• 通讯作者: 八木年晴

ピリドキサールの制菌効果

吡哆醛的抗菌作用

• 发表时间: 2007
• 作者: 西山雄二;宮崎裕助;斉藤渉;大河内泰樹;竹内綱史;野口雅弘;北川東子;早尾貴紀;藤田尚志;大場淳;水月昭道;片柳榮一 編(竹内綱史 他 著);Yu Yoshikane;Saki Nishimura;Fei Ge;Nana Yokochi;松本 空;吉金 優;横地 奈菜
• 通讯作者: 横地 奈菜

根粒菌由来ピリドキサミン-ピルビン酸アミノトランスフェラーゼの立体構造解析

根瘤菌吡哆胺-丙酮酸转氨酶的三维结构分析

• 发表时间: 2007
• 作者: 西山雄二;宮崎裕助;斉藤渉;大河内泰樹;竹内綱史;野口雅弘;北川東子;早尾貴紀;藤田尚志;大場淳;水月昭道;片柳榮一 編(竹内綱史 他 著);Yu Yoshikane;Saki Nishimura;Fei Ge;Nana Yokochi;松本 空;吉金 優;横地 奈菜;横地 奈菜;横地 奈菜;吉金 優
• 通讯作者: 吉金 優

ビタミンB_6分解系酵素5-formyl-3-hydroxy-2-methylpyridine-4-carboxylic acidデヒドロゲナーゼ(ジスムターゼ)の構造と機能

维生素B_6降解酶5-甲酰基-3-羟基-2-甲基吡啶-4-羧酸脱氢酶（歧化酶）的结构与功能

• 发表时间: 2007
• 作者: 別府佑一;ホアン ブ;三宅丈雄;山本英明;谷井孝至;佐藤裕子;大泊巌;Saki Nishimura;葛飛;松本空;吉金 優;横地 奈菜;横地 奈菜
• 通讯作者: 横地 奈菜

NAD^+依存性ジスムターゼの反応機構

NAD^+依赖性歧化酶的反应机制

• 发表时间: 2009
• 作者: 別府佑一;ホアン ブ;三宅丈雄;山本英明;谷井孝至;佐藤裕子;大泊巌;Saki Nishimura;葛飛;松本空
• 通讯作者: 松本空