サーカディアンリズムの中枢を担う時計因子複合体の分子解剖

在昼夜节律中发挥核心作用的时钟因子复合物的分子解剖

基本信息

批准号：
07J00199
负责人：
吉種光
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

概日時計の分子発振システムにおいて、時計タンパク質CLOCKとBMAL1の複合体はE-boxを含む時計シスエレメントに結合して転写を活性化する。転写・翻訳された負の因子群は、CLOCK-BMAL1複合体を不活性化することにより自らの転写を抑制する。この負の因子群によるCLOCK-BMAL1複合体の不活性化機構の分子実態は謎に包まれているが、時計タンパク質の翻訳後修飾が極めて重要な役割を担うと考えられる。そこで私は、この時計因子複合体を形成する構成因子の時刻依存的な変動をタンパク質レベルで把握することが、時計発振の真の理解に重要かつ不可欠であると考えた。この目的に向け私は、時計因子複合体の中枢因子であるCLOCKを認識するモノクローナル抗体を作製し、CLOCKが転写抑制期にリン酸化されていることを見出した。このCLOCKリン酸化の生理的意義に迫るため、マウス肝臓から単離したCLOCKを質量分析に供してリン酸化部位を決定した。このリン酸化部位変異体の解析より、CLOCKのリン酸化はCLOCKの核移行を阻害すると共に、CLOCK-BMAL1複合体のDNA結合力を低下させることにより、転写活性促進を抑制することが判明した。興味深いことに、CLOCKのリン酸化状態は負の因子CIPCの共発現により促進し、CIPC結合ドメインを欠いたCLOCK変異体は低リン酸化状態であることを見出した。さらにこの変異CLOCKは細胞内蓄積量が大幅に増大しており、薬剤処理によりCLOCKのリン酸化を強制的に亢進させたところ、過リン酸化されたCLOCKはプロテアソームを介した分解に導かれることが分かった。以上の結果は、時計タンパク質へのリン酸化シグナルがタンパク質機能を巧みに調節してE-boxの転写抑制に寄与している可能性を示唆している。

在生物钟的分子振荡系统中，时钟蛋白 CLOCK 和 BMAL1 的复合物与包括 E-box 在内的时钟顺式元件结合并激活转录。转录和翻译的负因子通过灭活 CLOCK-BMAL1 复合物来抑制自身转录。尽管这组负面因素导致 CLOCK-BMAL1 复合物失活机制的分子细节仍笼罩在神秘之中，但时钟蛋白的翻译后修饰被认为发挥着极其重要的作用。因此，我相信，了解在蛋白质水平上形成该时钟因子复合物的组成因素的时间依赖性波动对于真正理解时钟振荡非常重要且必不可少。为此，我创建了一种可识别时钟因子复合物中的核心因子 CLOCK 的单克隆抗体，并发现 CLOCK 在转录抑制阶段被磷酸化。为了研究这种 CLOCK 磷酸化的生理意义，我们对从小鼠肝脏中分离出的 CLOCK 进行了质谱分析以确定磷酸化位点。对该磷酸化位点突变体的分析表明，CLOCK 的磷酸化不仅抑制 CLOCK 的核转位，而且还通过降低 CLOCK-BMAL1 复合物的 DNA 结合能力来抑制转录活性的促进。有趣的是，我们发现负因子CIPC的共表达促进了CLOCK的磷酸化状态，并且缺乏CIPC结合域的CLOCK突变体被低磷酸化。此外，这种突变体CLOCK在细胞中的积累量显着增加，当通过药物治疗强制增加CLOCK的磷酸化时，过度磷酸化的CLOCK会通过蛋白酶体被引导降解。这些结果表明，时钟蛋白的磷酸化信号可能巧妙地调节蛋白功能并有助于 E-box 转录抑制。