細胞外環境、細胞接着および血管新生による新しい骨再生モデルの解析

基于细胞外环境、细胞粘附和血管生成的新型骨再生模型分析

基本信息

批准号：
18791465
负责人：
秋山真理
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Osaka Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

組織再生のプロセスを明らかにすることを目的として、牛骨膜細胞を用いた骨再生モデルにおいて細胞外環境、細胞接着、血管新生の3点の観点から研究を行った。まず、細胞外環境を調べるために培養細胞の上清を採取し、沈澱させて得たタンパク質を用いてウエスタンブロット法にて目的とするタンパク質の検出を行った。その結果、培養液にアスコルビン酸を添加した場合、培養上清にはプロコラーゲンタイプ1およびコラーゲンタイプ1の両方が含まれていることが明らかになった。しかし、アスコルビン酸無添加では、これらのタンパク質のバンドを検出できなかった。次に細胞接着と骨再生の関連性を調べるため、培養細胞をヌードマウス皮下に移植した。アスコルビン酸添加条件で培養した骨膜細胞では生体内で骨組織の形成が認められたのに対して、アスコルビン酸無添加条件では細胞を支持する細胞外マトリックスがないため、細胞同士の結合が弱く、移植部が消失し、骨組織も認められなかった。以上の結果から、骨膜細胞によるコラーゲン合成と生体内での骨再生には関連性があることが示唆された。さらに、培養上清を生体内における組織再生の予測に使用できる可能性も示された。最後に骨再生モデルにおける血管新生の過程を、マウスと牛とで異なる染色挙動の血管内皮細胞マーカーを用いて調べた。すなわち、Von Willebrand因子抗体はマウスおよび牛に交差反応を示すが、CD31抗体は牛に交差反応を示さず、マウスのみで発現する。ヌードマウス皮下で、牛骨膜細胞による骨再生が認められた組織切片をVon Willebrand因子抗体およびCD31抗体で免疫染色を行った結果、両抗体で発現が認あられた。したがって、本研究における動物モデルでは、血管新生は宿主側のヌードマウスに由来することが示唆された。

为了阐明组织再生的过程，我们从细胞外环境、细胞粘附和血管生成三个角度进行了利用牛骨膜细胞的骨再生模型的研究。首先，为了检查细胞外环境，收集培养细胞的上清液，并使用沉淀的蛋白质通过蛋白质印迹法检测目的蛋白质。结果表明，当培养基中添加抗坏血酸时，培养上清液中同时含有1型原胶原和1型胶原。然而，如果不添加抗坏血酸，则无法检测到这些蛋白质条带。接下来，为了研究细胞粘附与骨再生之间的关系，将培养的细胞皮下移植到裸鼠体内。在添加抗坏血酸的条件下培养的骨膜细胞，在体内观察到骨组织的形成，而在不添加抗坏血酸的条件下，没有细胞外基质来支撑细胞，因此细胞之间的结合很弱。移植区域消失，未观察到骨组织。上述结果提示骨膜细胞合成胶原蛋白与体内骨再生之间存在关系。此外，还证明了使用培养上清液预测体内组织再生的可能性。最后，利用小鼠和牛之间具有不同染色行为的血管内皮细胞标记物研究了骨再生模型中的血管生成过程。即，冯维勒布兰德因子抗体在小鼠和牛中表现出交叉反应性，但CD31抗体在牛中不表现出交叉反应性，并且仅在小鼠中表达。将裸鼠皮下观察到牛骨膜细胞骨再生的组织切片用冯维勒布兰德因子抗体和CD31抗体进行免疫染色，观察两种抗体的表达。因此，在本研究的动物模型中，血管生成被认为起源于裸鼠宿主侧。