後天性表皮水疱症診断のための高感度ELISAシステムの開発

开发用于诊断获得性大疱性表皮松解症的高灵敏度 ELISA 系统

• 批准号: 18790769
• 负责人: 安川 香菜
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18790769/
• 关键词: 後天性表皮水疱症; VII型コラーゲン; 自己抗体; 酵素結合免疫吸着定量法; 大量培養; イオン交換クロマトグラフィー; 硫安塩折; ゲルろ過クロマトグラフィー

後天性表皮水庖症の原因蛋白であるVII型コラーゲン蛋白を抗原とした酵素結合免疫吸着定量法(ELISA)を作成するためには、精製したVII型コラーゲン蛋白が大量に必要となる。そのためにまずVII型コラーゲン蛋白を恒常的に発現する293A細胞を回転培養器により大量培養を行った。培養液の上清を硫安塩析し、透析した。次にVII型コラーゲン蛋白のNC-1domainに対する抗体であるLH7.2抗体を担体プロテインGに結合させたLH7.2抗体カラムを作成し、透析したサンプルを通したのちトリフルオロ酢酸にて抗体と蛋白の結合を切断しVII型コラーゲン蛋白を溶離した。しかしこの方法ではVII型コラーゲン蛋白以外の不純蛋白が混入してしまうことが判明したため、精製法をイオン交換アフィニティーに変更した。これで得られた290kDaの蛋白を選択し、それをさらにゲル濾過アフィニティーにて精製した。しかしこれは濃度が薄いため、アミコンを用いて濃縮した。しかし、大量精製用の1.2リットルのボトルの培養液から透析後に得られる蛋白量は23mgでそれがゲル濾過アフィニティー後は0.3mgとなり、濃縮後はさらにその半分の0.15mgで、回収率は0.65%である。ELISAの抗原として使用するためのVII型コラーゲン蛋白量が不足しているため、今後は回収率をあげるか、または培養器の数を増やすことが必要と考えている。そして十分量のVII型コラーゲン蛋白が準備できしだい、ELISAの作成を行なう予定である。

为了使用VII型胶原蛋白（获得性水痘表皮松解症的致病蛋白）作为抗原建立酶联免疫吸附测定（ELISA），需要大量纯化的VII型胶原蛋白。为此，我们首先在旋转培养箱中培养组成型表达VII型胶原蛋白的293A细胞。将培养液的上清液用硫酸铵盐析并透析。接下来，通过将LH7.2抗体（针对VII型胶原蛋白的NC-1结构域的抗体）与载体蛋白G结合来制备LH7.2抗体柱。在通过透析的样品后，将抗体和蛋白分离。与三氟乙酸结合，通过裂解键洗脱VII型胶原蛋白。但发现该方法导致了VII型胶原蛋白以外的杂质蛋白的污染，因此将纯化方法改为离子交换亲和法。选择所得的 290 kDa 蛋白质并使用凝胶过滤亲和力进一步纯化。然而，由于浓度较低，因此使用 Amicon 对其进行浓缩。然而，从一瓶1.2升的大规模纯化培养液中透析后得到的蛋白量为23mg，经过凝胶过滤亲和后变成0.3mg，浓缩后为一半，为0.15mg，回收率为0.65%。由于VII型胶原蛋白的量不足以在ELISA中用作抗原，我们认为未来有必要提高回收率或增加培养容器的数量。一旦制备了足够量的 VII 型胶原蛋白，我们计划创建 ELISA。