接着分子による骨髄腫細胞の増殖、分化制御機構の解明

阐明粘附分子控制骨髓瘤细胞增殖和分化的机制

基本信息

批准号：
18790652
负责人：
安見正人
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18790652/
关键词：
骨髄腫 N-Cadherin 薬剤耐性多発性骨髄腫接着因子骨髄微小環境 N-cadherin

项目摘要

骨髄腫培養細胞株を用いてRT-PCR法およびウエスタンブロット法によりN-Cadherinの発現を確認した。12細胞株中8細胞株にてN-Cadherinの発現を認めた。N-Cadherinと細胞内において複合体を形成するα-Catenin,β-CateninもN-Cadherin陽性培養細胞株すべてに発現を認めた。抗N-Cadhrin抗体および抗β-Catenin抗体を用いた免疫沈降法にてα-Catenin,β-CateninおよびN-Cadhrin,α-Cateninはそれぞれ共免沈された。臨床検体を用いて抗light chain抗体および抗N-Cadherin抗体による免疫染色により骨髄腫細胞でのN-Cadherinの発現を確認した。9症例すべてにおいてN-Cadherinの発現を認めた。骨髄腫培養細胞株を用いN-Cadherin細胞外領域キメラタンパク質(N-Cadherin-Fc)をコートしたディシュ上での接着実験を行った。骨髄腫培養細胞株とN-Cadherin-Fcとの接着は時間およびN-Cadherin-Fc量依存性に増加し、またこの接着はN-Cadherin細胞外領域を認識する阻害抗体、およびEGTA存在下にて阻害された。これらの結果から骨髄腫細胞には機能的なN-Cadherin-Catenin複合体が発現していることが示唆された。次にN-Cadherinの細胞接着による薬剤耐性を検討したMelphalall(30μM),Doxorubicine(1μM)存在下にて48時間培養後、PI染色を行った。浮遊培養ではそれぞれ70%,40%の細胞がPI陽性であったのに対し、N-Cadherin-Fcをコートしたディシュ上で24時間培養後薬剤を加えた群ではPI陽性細胞はそれぞれ5%,10%と低下を認めた。以上の結果からN-Cadherinによる細胞接着が骨髄腫の薬剤耐性に関与し耐性克服への分子標的となる可能性が示唆された。

使用骨髓瘤培养细胞系通过 RT-PCR 和蛋白质印迹法证实 N-钙粘蛋白的表达。在 12 个细胞系中的 8 个中观察到 N-钙粘蛋白表达。与 N-钙粘蛋白形成细胞内复合物的 α-连环蛋白和 β-连环蛋白也在所有 N-钙粘蛋白阳性培养细胞系中表达。使用抗N-Catenin抗体和抗β-Catenin抗体通过免疫沉淀法对α-Catenin、β-Catenin和N-Catenin进行共免疫沉淀。使用临床标本，我们通过抗轻链抗体和抗 N-钙粘蛋白抗体的免疫染色证实了骨髓瘤细胞中 N-钙粘蛋白的表达。 9例均观察到N-Cadherin表达。使用培养的骨髓瘤细胞系在涂有 N-钙粘蛋白胞外域嵌合蛋白 (N-钙粘蛋白-Fc) 的培养皿上进行粘附实验。培养的骨髓瘤细胞系和 N-Cadherin-Fc 之间的粘附以时间和 N-Cadherin-Fc 量依赖性方式增加，并且在识别 N-Cadherin 和 EGTA 细胞外区域的抑制性抗体存在时，这种粘附会增加被抑制了。这些结果表明骨髓瘤细胞表达功能性 N-钙粘蛋白-连环蛋白复合物。接下来，在Melfalall (30 μM)和阿霉素(1 μM)存在下培养48小时以检查N-钙粘蛋白的细胞粘附引起的耐药性，然后进行PI染色。在悬浮培养中，分别有 70% 和 40% 的细胞呈 PI 阳性，而在 N-Cadherin-Fc 包被的培养皿上培养 24 小时后添加药物的组中，分别有 5% 和 40% 的细胞呈 PI 阳性。 PI 呈阳性，分别观察到下降 10%。这些结果表明，N-钙粘蛋白介导的细胞粘附与骨髓瘤的耐药性有关，并且可以作为克服耐药性的分子靶标。