ミオシン重鎖アイソフォームから探る魚類の筋形成の分子メカニズム

从肌球蛋白重链亚型探索鱼肌肉形成的分子机制

基本信息

批准号：
18780160
负责人：
木下滋晴
金额：
$ 2.24万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

メダカの筋形成過程で発現する主要なミオシン重鎖(myosin heavy chain, MYH)アイソフォームであるmMYH_<L1>、mMYH_<L2>およびmMYH_<emb1>につき、RACE法により転写開始点を同定した。次に、転写開始点から5'上流の配列をゲノムデータベースから抽出し、他生物種の相同領域とのホモロジー解析を行ったところ、mMYH_<emb1>の5'上流1kb付近にトラフグ胚体で発現するMYH_<M2528-2>の5'上流と高い相同性を示す領域が得られた。当該領域を含むmMYH_<emb1>の5'上流2kbをGFPをレポーターとするベクターに連結し、メダカ受精卵に導入したところ、メダカ胚の水平筋隔に限定したGFPの発現が観察された。同様の発現はゼブラフィッシュでも観察された。こうしたGFP陽性細胞の分布は遅筋型MYHを発現するmuscle pioneerのものと類似するが、特異抗体を用いた免疫染色の結果、GFP陽性細胞はmuscle pioneerのマーカーであるengrailedを発現しておらず、mMYH_<emb1>を発現する筋細胞の性状や発生の系譜に興味がもたれた。また、mMYH_<L1>およびmMYH_<L2>については、それぞれ翻訳開始点の5'上流2.6kbおよび4kbを連結したレポーターベクターを導入することで、メダカおよびゼブラフィッシュ胚の速筋でGFPの発現が観察された。これら結果から、MYHの5'上流には魚類の異なる筋組織での発現を制御するシス制御領域が存在することが示された。また、昨年度は筋特異的タンパク質の転写制御に関与する筋分化制御因子myoD familyをメダカからクローニングし、その発現パターンのプロファイリングを行った。今年度はこれら筋分化制御因子の活性調節に関与することがほ乳類で報告されているヒストンのアセチル化について検討した。メダカおよびゼブラフィッシュ受精卵をヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤であるバロプロ酸で処理したところ、発生の遅滞や体幹部の屈曲が観察された。特異抗体を用いた組織学的解析により、これら胚では本来表皮直下に単層を形成する遅筋細胞が重層化する異常が観察された。

使用 RACE 方法鉴定了 mmYH_<L1>、mmYH_<L2> 和 mmYH_<emb1> 的转录起始位点，它们是青鳉肌生成过程中表达的主要肌球蛋白重链 (MYH) 亚型。接下来，我们从基因组数据库中提取转录起始点上游的5'序列，并与其他物种的同源区域进行同源性分析，获得了与MYH_<M2528-2>的5'上游表现出高度同源性的区域。当我们使用 GFP 作为报告基因将包含该区域的 mmYH_<emb1> 的 5' 上游 2kb 连接到载体并将其引入青鳉受精卵时，我们观察到 GFP 表达仅限于青鳉胚胎的水平肌肉隔膜。在斑马鱼中也观察到类似的表达。这些 GFP 阳性细胞的分布与表达慢肌先锋 MYH 的肌肉先锋相似，但使用特异性抗体进行免疫染色后，GFP 阳性细胞不表达 engrailed，这是肌肉先锋的标志物。对表达 mmYH_<emb1> 的肌肉细胞的特性和发育谱系感兴趣。此外，对于mmYH_<L1>和mmYH_<L2>，通过分别引入连接至翻译起始位点上游2.6kb和4kb 5'上游的报告载体，在青鳉鱼和斑马鱼胚胎的快肌中检测到GFP表达。观察到。这些结果表明，MYH 5'上游存在一个顺式调控区，控制其在鱼类不同肌肉组织中的表达。此外，去年我们克隆了参与青鳉鱼肌肉特异性蛋白转录控制的肌肉分化调节因子 myoD 家族，并分析了它们的表达模式。今年，我们研究了组蛋白乙酰化，据报道在哺乳动物中组蛋白乙酰化参与调节这些肌肉分化调节因子的活性。当青鳉鱼和斑马鱼的受精卵用丙戊酸处理时，观察到组蛋白脱乙酰酶抑制剂、发育迟缓和躯干弯曲。使用特异性抗体的组织学分析揭示了这些胚胎的异常情况，其中通常在表皮下方形成单层的慢肌细胞变得分层。