大腸菌染色体複製の開始制御の分子機構:開始因子DnaAタンパク質の機能制御機構

大肠杆菌染色体复制起始控制的分子机制：起始因子DnaA蛋白的功能控制机制

基本信息

批准号：
07780603
负责人：
片山勉
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、大腸菌における染色体複製の制御機構の解明をめざし、複製開始タンパク質DnaAの活性制御因子を探索し同定することが目的であった。目的とした因子はDnaAタンパク質を特異的に認識して不活性化するタンパク性因子であり、研究代表者が独自に見いだしたものである(Katayama、T.、and Crooke、E.(1995)J.Biol.Chem.270、9265-9271)。この因子によって不活性化されたDnaAタンパク質は、ミニ染色体の試験管内複製反応に対する活性を失っている。目的の因子を精製して同定するため、まず大腸菌の大量培養を行った。次に、DnaAタンパク質の不活性化を指標に、種々の分画法を試みた。最終的に分画に用いた手法は、1.硫安沈殿、2.DE52(Whatman)、3.ヒドロキシアパタイト、4.FPLC mono-Q、5.FPLC superdex200、6.FPLC mono-Pであった。最終分画の段階において、DnaAタンパク質の不活性化と挙動を共にするタンパク性因子を認めることができた。この因子の実体を明らかにするため、自動エドマン分解法によるアミノ酸配列決定を行ったところ、N-末端3残基を明らかにすることができた。現在、さらに多くのアミノ酸配列を知るため、大量精製を行っている。また、本研究を滞りなく進行させるためには、DnaAタンパク質の安定供給体制の確立も重要であった。かつてはDnaAタンパク質は精製が難しくため収量が低く、これが生化学的研究の足かせとなっていた。研究代表者はまず、DnaAタンパク質の大量発現系に根本的な改良を加え、菌体全タンパク質の約15%までDnaAタンパク質が蓄積する系を新たに確立した。さらに精製法にも改良工夫を加え、50gの菌体から10mgのDnaAタンパク質を精製できる実験系を見いだした(未発表)。

本研究的目的是探索和鉴定控制复制起始蛋白DnaA活性的因素，以阐明大肠杆菌染色体复制的控制机制。目标因子是主要研究者独立发现的特异性识别DNAA蛋白并使其失活的蛋白因子(Katayama, T., and Crooke, E. (1995) J.Biol.Chem.270, 9265-9271) 。被该因子灭活的 DnaA 蛋白在微型染色体的体外复制反应中失去活性。为了纯化和鉴定所需因子，我们首先对大肠杆菌进行了大规模培养。接下来，我们以 DnaA 蛋白失活为指标，尝试了各种分级方法。最终用于分级的方法是：1.硫酸铵沉淀，2.DE52(Whatman)，3.羟基磷灰石，4.FPLC mono-Q，5.FPLC superdex200，和6.FPLC mono-P。在最后的分级分离阶段，观察到一种蛋白质因子，其行为方式与灭活 DnaA 蛋白质相同。为了阐明该因子的实质，我们使用自动Edman降解确定了氨基酸序列，并能够鉴定出三个N末端残基。目前，正在进行大规模纯化以获得更多的氨基酸序列。此外，为了使这项研究顺利进行，建立稳定的DnaA蛋白供应系统也很重要。过去，DnaA蛋白难以纯化，导致产量低，阻碍了生化研究。首席研究员首先对DnaA蛋白的大规模表达系统进行了根本性的改进，建立了一个新的系统，其中DnaA蛋白积累到细菌细胞内总蛋白的约15%。此外，我们改进了纯化方法，发现了可以从50 g细菌细胞中纯化10 mg DnaA蛋白的实验系统（未发表）。