リボザイム活性を持つウイルスを用いた肢芽形態形成時におけるHox遺伝子機能阻害

使用具有核酶活性的病毒抑制肢芽形态发生过程中的 Hox 基因功能

基本信息

批准号：
07780652
负责人：
横内裕二
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780652/
关键词：
ニワトリ肢芽水掻き apoptosis BMP2 BMP4 virus vector 遺伝子導入欠損型受容体

项目摘要

TGF-β familyに属するBMP2/4は本来骨形成促進因子として単離さた因子であり、様々な発生過程において重要な機能をになっていることが知られている。四肢の形態形成過程において、BMP2はZPA領域、BMP4は予定細胞死領域と一致して発現することから、これらは肢芽の前後軸形成のsignalingあるいは間充織細胞のprogrammed cell death(apoptosis)に関与していることが予想された。今回我々は、virus vectorによって細胞内領域欠損型BMP受容体(以下deltaBMPR-Iと略)を肢芽間充織で強制発現させることによってBMP signalを阻害し、肢芽形成時におけるBMPの機能を明らかにすることを試みた。今回用いたdeltaBMPR-1はXenopusの初期発生時においてBMP4活性を阻害することがすでに明らかにされている。定法に従って複製可能なdeltaBMPR-1 virusを作成し、1.5日胚の予定後肢領域に感染させ後日表現型を解析した。7.5日胚では、第1指の前方と第4指の後方に過剰な間充織組織が形成され、10日胚では、本来消失するはずの指間のweb(水掻き)が残存していた。いずれもapoptosisによって間充織細胞が除去される領域であることから、肢芽形成時においてBMP2/4は間充織細胞のapoptosisのシグナル因子となっていることが示唆された。次にBMP2/4タンパクが肢芽水掻き間充織細胞の細胞死を誘導するのかin vitroで解析したところ、これらの投与によって細胞死が誘導された。他のTGF-β familyであるTGF-β1,Activinは細胞死を誘導しなかった。以上の結果より、BMP2/4は肢芽水掻き間充織のapoptosisを支配する特異的な因子であることが証明された。(課題名と内容が異なる理由は以上の通りです。申請書作成後に,マウスを用いたHoxa-13の遺伝子破壊実験が完了間近なことが判明し、リボザイムによる機能阻害は無意味であると判断しました。その代わりにその当時まだ行われていなかったBMP2/4の阻害実験を行いました。)

BMP2/4属于TGF-β家族，最初是作为骨形成促进因子被分离出来的，已知在各种发育过程中发挥重要作用。在肢体形态发生过程中，BMP2在ZPA区表达，BMP4在预定细胞死亡区表达，因此这些可能参与肢芽前后轴形成或间充质细胞程序性细胞死亡（凋亡）的信号传导预计会参与其中。在这项研究中，我们通过使用病毒载体在肢芽间充质中强制表达细胞内区域缺陷的BMP受体（deltaBMPR-I）来抑制BMP信号，从而抑制BMP在肢芽形成过程中的功能。这里使用的 deltaBMPR-1 已被证明可以在非洲爪蟾的早期发育过程中抑制 BMP4 活性。我们根据标准方法创建了具有复制能力的 deltaBMPR-1 病毒，感染了 1.5 天大胚胎的预期后肢区域，并在稍后分析了表型。在7.5天的胚胎中，第一根手指的前面和第四根手指的后面形成了过多的间质组织，而在10天的胚胎中，本应消失的手指之间的蹼仍然存在。由于两者都是间充质细胞因凋亡而被去除的区域，因此表明BMP2/4是肢芽形成过程中间充质细胞凋亡的信号因子。接下来，我们在体外分析了BMP2/4蛋白是否诱导肢芽水间充质细胞死亡，发现它们的施用会诱导细胞死亡。 TGF-β 家族的其他成员，TGF-β1 和激活素，不会诱导细胞死亡。这些结果表明BMP2/4是控制肢芽房水间质细胞凋亡的特异性因子。（项目名称和内容不同的原因如下。创建应用程序后，发现使用小鼠的Hoxa-13基因破坏实验已接近完成，并确定用核酶抑制功能相反，我们进行了BMP2/4抑制实验，当时还没有进行。