可動性遺伝因子による部位特異的染色体切断を利用した組換えの研究

利用移动遗传元件进行位点特异性染色体断裂的重组研究

基本信息

批准号：
18870024
负责人：
福田智行
金额：
$ 1.74万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18870024/
关键词：
減数分裂組換え出芽酵母二重鎖切断 Spoll VDE Spo11

项目摘要

減数分裂期組換えは、Spollタンパク質が染色体DNAを切断することで開始され、切断が相同染色体を鋳型とした相同組換えで修復されることで完了する。この際の各染色体上には、SpollによるDNA切断が高頻度に生じる箇所(ホットスポット)が集中する領域(ホットドメイン)と、切断がほとんど生じない領域(コールドドメイン)とが特徴的に分布する。こうした減数分裂期組換えの位置を制御する機構の解明を目的として、出芽酵母の染色体にSpollや他のヌクレアーゼをターゲッティングすることで人為的な切断を導入するというアプローチを試みた。その結果、Spollを強制的にコールドドメインに結合させても切断は著しく妨げられることが明らかになった。更に、ホットドメインではSpollが多量体化して切断反応を活性化するのに対し、コールドドメインではたとえ染色体に結合しても単量体のままであることを見いだした。以上から、染色体領域に依存したSpollの活性化あるいは抑制機構の存在が示唆された。次に、ホットスポット近傍に人為的な染色体切断を引き起こし、その効果を解析した。その結果、導入した切断がホットスポットでの切断を抑制することを観察した。この効果は広範囲(30kb以上)に渡って見られ、導入した切断の活性が高いほどより強く作用していた。また、抑制効果は切断の生じた染色体上だけでなく、切断が生じていない相同染色体上のホットスポットにも作用していた。一方、ホットスポットの必要条件を満たした箇所が近傍に複数存在している場合には、切断の活性化をめぐって互いが競合することと、この競合は同一染色体にのみに作用し、相同染色体上へは作用しないこととを明らかにした。かくして、減数分裂期組換えが特定の領域でごく少数だけ起きるように、切断の前後で複数の制御が存在していることが示唆された。

减数分裂重组在 Spoll 蛋白断裂染色体 DNA 时启动，并在使用同源染色体作为模板通过同源重组修复断裂时完成。此时，在每条染色体上，存在由Spoll引起的DNA断裂集中的区域（热域）和很少发生DNA断裂的区域（冷域）的特征性分布。为了阐明控制减数分裂重组位置的机制，我们尝试了一种通过靶向 Spoll 和其他核酸酶在酿酒酵母染色体中引入人工断裂的方法。结果表明，即使Spoll被迫与冷域结合，裂解也会受到显着阻碍。此外，他们发现在热域中，Spoll 多聚化并激活裂解反应，而在冷域中，Spoll 即使与染色体结合时仍保持单体状态。这些结果表明存在染色体区域依赖性 Spoll 激活或抑制机制。接下来，我们在热点附近制造了人工染色体断裂并分析了其影响。结果，我们观察到引入的裂解抑制了热点处的裂解。在较宽的范围（超过30kb）内观察到该效果，并且引入的切割的活性越高，效果越强。此外，抑制效果不仅作用于发生断裂的染色体，还作用于同源染色体上未发生断裂的热点。另一方面，如果附近有多个符合热点要求的位点，它们就会相互竞争裂解的激活，而这种竞争只会影响同一条染色体，而不会影响裂解的激活。结果发现它不起作用。这表明在分裂前后存在多重控制，因此减数分裂重组仅在特定区域发生少量。