情報伝達蛋白質Raf1の分子内構造変化と活性調節の相関の細胞内1分子可視化解析

细胞内单分子可视化分析信息转导蛋白Raf1分子内结构变化与活性调控的相关性

基本信息

批准号：
18810042
负责人：
日比野佳代
金额：
$ 1.74万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞の増殖や分化に関わる重要な細胞内情報伝達反応の一つ低分子量G蛋白質Rasからセリン/スレオニンキナーゼRaflへの情報伝達反応の分子機構を明らかにするため、Raflの活性調節に重要だと考えられている分子内構造変化を、昨年度開発に成功した1分子可視化解析システムを用いて、生きた細胞内で計測した。Raflの構造変化プローブは、2色の蛍光タンパク質の間で起こる蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を利用したプローブで、Raf分子の球状態から鎖状態への構造変化をFRET信号の変化として検出することができる。このRaf分子の構造変化プローブをHeLa細胞に発現させ、生きた細胞内で1分子毎に可視化解析して、上皮成長因子(EGF)刺激前後の、Raflの構造を計測した。この結果、不活性化型Ras(RasGDP)と結合したRafと、活性化型Ras(RasGTP)と結合したRafでは、初期結合の状態が大きく異なることを明らかにした。また、細胞質中に存在するRafや、細胞膜のRasGDPと結合したRafは球状態をとり、RasGTPと結合したRafは球状態から鎖状態へと直ちに構造変化することが示唆された。これらの結果により、「活性化型Rasは、Rafの単なる高親和性結合部位として働くのではなく、Rafの構造変化を誘導し、その活性制御を直接的に行う」というRasによる新しい情報伝達反応の制御機構を提案し、この成果を、2007年12月、日本生物物理学会第45回年会、及び、2008年2月、Joint Meeting of the Biophysical Society 52nd Annual Meeting & 16th International Biophysics Congress(IUPAB)で発表した。

为了阐明从RAS（低分子量G蛋白）对丝氨酸/苏氨酸激酶的分子机制，RAFL是细胞增殖和分化涉及的重要细胞内信号反应之一，涉及分子内的结构变化，这对于使用RAR的活性进行了实现的活性，这是对实现生命的活性的重要性，这些变化很重要。 RAFL的结构变化探针是利用两种颜色荧光蛋白之间发生的荧光共振能量转移（FRET）的探针，并且可以检测Raf分子从球体到链状态的结构变化，因为FRET信号的变化。这种RAF分子的结构变化探针在HeLa细胞中表达，并对活细胞中的每个分子进行了可视化和分析，并测量了表皮生长因子（EGF）刺激之前和之后RAFL的结构。结果，揭示了与灭活的Ras（RasGDP）和与激活的Ras（RASGTP）结合的RAF之间的初始结合状态显着差异。还建议在细胞质中存在的RAF和与细胞膜中rasgDP结合的RAF在球体状态下，而与RasGTP结合的RAFS立即将构象从球体状态变为链状态。 Based on these results, we proposed a new mechanism for controlling information transmission reactions by Ras, which states that "activated Ras does not simply act as a high affinity binding site for Raf, but induces structural changes in Raf and directly regulates its activity," and presented these results at the 45th Annual Meeting of the Biophysical Society in December 2007, and at the Joint Meeting of the Biophysical Society 52nd Annual Meeting & 16th International Biophysics Congress （IUPAB）2008年2月。