DNAミスマッチのDNA複製酵素による伸長と熱力学的安定性についての研究

DNA复制酶对DNA错配的延伸和热力学稳定性研究

• 批准号: 06780566
• 负责人: 紙谷 浩之
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: University of Occupational and Environmental Health, Japan
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780566/
• 关键词: ミスマッチ; DNAポリメラーゼ; 伸長反応; 熱力学的安定性

最初に8-ヒドロキシグアニン(8-OHG)を含むDNA断片を高収率かつ簡便に合成可能な新規ホスホロアミダイト体を化学合成した。これをビルディングブロックとして用い、DNA自動合成機を用いて8-OHGを含むオリゴヌクレオチドを合成し、HPLCを用いて高純度に精製した。次にオリゴヌクレオチドを酵素的に連結させ、鋳型DNAを調整した。3'-末端にミスマッチを含むプライマーと鋳型DNAをアニーリングさせ、哺乳動物細胞から調整したDNAポリメラーゼαを用いて、DNA鎖伸長反応を行った。電気泳動を用いて分析したところ、G:T(鋳型:プライマー)塩基対の伸長と、配列によってはG:A(鋳型:プライマー)塩基対の伸長が観察された。一方、8-OHGの場合には、8-OHG:C、8-OHG:A(鋳型:プライマー)塩基対の伸長と、配列によっては8-OHG:T(鋳型:プライマー)塩基対の伸長が観察された。以上の結果を、同一配列を用いて測定した熱力学的安定性と比較したところ、予想とは異なり、Gの場合にも8-OHGの場合にも、DNAポリメラーゼαによる伸長と熱力学的安定性には直接的な相関関係がないことが明らかとなった。以上、本研究で得られた結果から、DNAポリメラーゼの塩基対伸長反応には、熱力学的安定性によって、一義的に決定しているのではなく、他の要因(例えば、塩基対の形やDNAポリメラーゼとの親和性)による影響が大きいことが明らかとなった。

首先，我们化学合成了一种新的亚磷酰胺，可以轻松高产率合成含有 8-羟基鸟嘌呤 (8-OHG) 的 DNA 片段。以此为基础，使用自动 DNA 合成仪合成了含有 8-OHG 的寡核苷酸，并使用 HPLC 纯化至高纯度。接下来，酶促连接寡核苷酸以制备模板DNA。将3'末端含有错配的引物与模板DNA退火，并使用由哺乳动物细胞制备的DNA聚合酶α进行DNA链延伸反应。当使用电泳分析时，观察到 G:T（模板：引物）碱基对的延伸，并且根据序列，观察到 G:A（模板：引物）碱基对的延伸。另一方面，在8-OHG、8-OHG:C、8-OHG:A（模板：引物）碱基对延伸的情况下，根据序列，8-OHG:T（模板：引物）碱基对延伸观察到对延伸。当我们将上述结果与使用相同序列测量的热力学稳定性进行比较时，我们发现，与预期相反，G和8-OHG都表明DNA聚合酶α的延伸与热力学稳定性之间没有直接相关性。性别。从本研究中获得的上述结果可以清楚地看出，DNA聚合酶的碱基对延伸反应主要不是由热力学稳定性决定的，而是由其他因素（例如碱基对形状等）决定的。与DNA聚合酶的亲和力影响较大。