未分化維持遺伝子が誘導する体細胞核再プログラム化機構の解明

阐明未分化维持基因诱导的体细胞核重编程机制

• 批准号: 17790190
• 负责人: 下崎 康治
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17790190/
• 关键词: ES細胞; 核再プログラム化; 未分化維持遺伝子; 幹細胞; 細胞融合

ES細胞特異的に発現するFbx15の欠損マウス胸腺細胞とES細胞とを電気的に細胞融合させ、G418による薬剤選択によって出現するコロニー数からES細胞のリプログラミング効率を測定した結果、約0.5%であることが分かった。またEGFPトランスジェニックマウス胸腺細胞と、野生型ES細胞、Nanogを導入したES細胞、及びNAT1欠損ES細胞とを細胞融合させFACS解析を行い、その融合効率を測定した結果、平均融合率は約10%であるのに対し、リプログラミング効率はNAT1欠損細胞及びNanog強制発現ES細胞は野生株に比べて約2.5倍の高さで胸腺細胞を再プログラムすることが明らかとなった。そこで核再プログラム化に関与する遺伝子解明のため、発現クローニングを試みた。まずNAT1欠損ES細胞からmRNAを抽出し、レトロウィルスベクターを骨格としたcDNAライブラリーを構築した。これを精巣由来細胞に感染導入した後、G418による薬剤選択を行った。残念ながら遺伝子導入による核再プログラム化を引き起こす遺伝子はこの実験系では検出できなかったが、この結果から核再プログラムは複数の遺伝子と協調的に行われていると想定できる。興味深いことに、ES細胞ではマスターレギュレーターとしてOct3/4、Nanog、Sox2の遺伝子群が深く関与していることが他研究グループよりCell誌に報告されたが、我々は精巣由来細胞及び、成体脳海馬領域由来神経幹細胞においてはこれらの遺伝子だけではES細胞に再プログラムされないことを実験的に確かめている。つまり、これらの遺伝子にプラスαの遺伝子が必須であることが想定されるため、構築したcDNAライブラリーをOct3/4、Nanog、Sox2を発現させた体細胞に導入し、同様な薬剤選択によるスクリーニングを行う予定である。

我们将ES细胞中特异表达的缺乏Fbx15的小鼠胸腺细胞与ES细胞进行电融合，并根据G418药物选择出现的集落数量来测量ES细胞的重编程效率。此外，我们通过将EGFP转基因小鼠胸腺细胞与野生型ES细胞、Nanog导入的ES细胞和NAT1缺陷的ES细胞融合进行FACS分析，并测量融合效率，结果平均融合率约为10。 ％，而NAT1缺陷细胞和Nanog强制表达ES细胞对胸腺细胞的重编程速度比野生型细胞系高约2.5倍。因此，我们尝试表达克隆来阐明参与核重编程的基因。首先，我们从NAT1缺陷的ES细胞中提取mRNA，并使用逆转录病毒载体作为骨架构建了cDNA文库。用其感染睾丸来源的细胞后，使用G418进行药物选择。不幸的是，在该实验系统中没有检测到通过基因转移引起核重编程的基因，但从该结果可以假设核重编程是与多个基因合作进行的。有趣的是，其他研究小组在《Cell》杂志上报道称，Oct3/4、Nanog 和 Sox2 基因作为 ES 细胞的主调节因子而深入参与，但我们研究了睾丸来源的细胞和成人大脑海马体，并通过实验证实了这一点。这些基因本身并不能将区域来源的神经干细胞重编程为胚胎干细胞。换句话说，由于假定除了这些基因之外的基因也是必需的，因此我们计划将构建的cDNA文库导入表达Oct3/4、Nanog和Sox2的体细胞中，并使用相同的药物选择方法进行筛选。 。