核の内膜タンパク質の小胞体から内膜への輸送機構の解明

阐明核内膜蛋白从内质网到内膜的转运机制

• 批准号: 17770166
• 负责人: 大場 誠介
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Tohoku University (2006)Kyushu University (2005)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17770166/
• 关键词: 核膜タンパク質; 核の外膜から内膜への輸送機構; 生きた細胞内での実験系; 核膜孔; rapamycin誘導複合体; 抗体のmicroinjection; タンパク質の輸送制限; lumen構造物

目的は、膜タンパク質の核の外膜から内膜への移動方法を明らかにする事にある。この目的を効果的に達成するために、生きた細胞内での膜タンパク質の移動の様子を観測する実験方法を構築した。これまでに、核の外膜-内膜移動方法として核膜孔の側でつながっている外膜と内膜の領域を通ってタンパク質が移動する方法が有力であることがわかっている。今年度、まず薬剤による輸送への影響を調べた。小胞体輸送、膜融合はカルシウムに依存している。そこで細胞内からカルシウムを除去するEGTA、BAPTAを加えたところ、輸送には影響しないことがわかった。つまり小胞体-ゴルジ体間の様な輸送とは異なる輸送機構があることが示唆された。更に、小胞体輸送、膜融合阻害剤として知られているNEMにおいても影響されなかった。またリン酸化に影響するstaurosporine、okadaicacidらの薬剤も膜タンパク質の核の内膜への移動を阻害しなかった。次に輸送に必要な細胞質の物質を明らかにするために新たな系を構築した。細胞に対してdigitonin処理を行い、核膜は正常なまま細胞膜のみ可溶化する。この状態の細胞を洗浄することで、細胞質画分を洗い流す。核膜、核の構造はそのままで、細胞質画分が洗い流された細胞に、別の細胞より抽出した細胞質を分画し、これを加え、輸送の様子を観察する。分画を進めることで輸送に必要な細胞質の物質を特定する。digitonin処理の条件を検討することにより、細胞膜が可溶化された細胞においても膜タンパク質の核の内膜への移動が観察された。この条件下で、核の構造が正常であることを証明するために、核移行シグナルを付加したBSA、NLS-BSA-Cy3を加えたところ、NLS-BSA-Cy3は核に蓄積した。この新たな系を用いることで、膜タンパク質の核の外膜から内膜への移動に必要な物質の同定が期待される。

目的是澄清如何将膜蛋白从核心外膜转移到子宫内膜。为了有效地实现此目的，建立了一种实验方法，以观察活细胞中膜蛋白的运动。迄今为止，已经表明，将蛋白质穿过外膜区域以及由核膜孔连接的子宫内膜作为核外膜 - 膜 - 尾式转移方法的方法具有影响力。今年，我们首先检查了药物运输的影响。钙取决于钙。从细胞中去除钙的EGTA和BAPTA的添加表明，运输不会影响。换句话说，有人建议有一种与运输不同的运输机制，例如基板和戈尔吉体之间。此外，它不受NEM的影响，NEM被称为末端载量运输和膜融合抑制剂。影响磷酸化的Staurope和Okadaicacid的药物没有抑制膜蛋白向核心子宫内膜的运动。接下来，建立了一个新系统，以阐明运输所需的细胞质细胞。 Digitonin加工在细胞上进行，核膜仅溶解细胞膜。通过在该状态下清洗细胞，将植物洗净。核膜和核的结构保持不变，并且将胞质的细胞洗净的细胞分为从另一个细胞中提取的细胞，添加它们并观察到运输。通过进行分裂，确定了运输所需的细胞质的物质。还可以检查膜蛋白加工的条件，从而观察到膜蛋白向细胞膜溶解细胞的子宫内膜的运动。在这些条件下，当具有核转变信号的BSA和NLS-BSA-CY3时，NLS-BSA-CY3积聚在核中，以证明核结构是正常的。通过使用这个新系统，可以预期从膜蛋白核心的核膜到从核心外膜移动到运动所需的物质。