スーパースピードコンジェニック法の新展開

超高速同类方法新进展

基本信息

批准号：
16700349
负责人：
尾畑やよい
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでの申請者らの知見で、インプリント遺伝子のDNAメチル化は卵母細胞のサイズに依存して確立していくこと、この卵子特異的なDNAのメチル化が受精後の正常な個体発生に必須であることが示されてきている。そのため、ゲノミックインプリンティングの確立に不可欠なDNAメチル基転移酵素遺伝子、Dnmt3aやDnmt3Lをゲノミックインプリンティングの確立していない未成長な卵母細胞で強制発現させることができれば、単為発生動物の生産も含め、非常に有効な生殖細胞利用技術になるものと考えられた。そこで本研究では、GFPをレポーター遺伝子として構築された発現ベクターを用い、エレクトロポーレーション法による新生仔非成長期卵母細胞への遺伝子導入を試みた。エレクトロポーレーションによる非成長期卵母細胞の発現ベクター導入効率および細胞生存率は、電気刺激の条件、緩衝液の種類および細胞濃度の3要因によって影響を受けた。エレクトロポーレーション時の細胞濃度は、5.0〜10.0×10^5個/100μlが最も良かった。また、22種類の電気刺激プログラムを試験したところ、最も良い条件では、導入効率2.6%および生存率20.9%となり、卵母細胞に導入されたGFPは、1週間以上強発現し続けた。しかし、NIH3T3などの体細胞株における遺伝子導入効率や生存率は共に80%以上と生殖細胞に比べて格段に高かった。次いで、GFPの下流にIRES配列とDnmt3Lを挿入した発現ベクターを構築し、エレクトロポーレーションにより卵母細胞への導入を試みた。その結果、GFPを指標とした導入効率は顕著に低下したが、導入処理後の遺伝子発現解析をRT-PCRにより行ったところ、外来性Dnmt3Lの発現が認められた。今後は非成長期卵母細胞におけるDnmt3L強制発現が、卵子特異的なDNAメチル化の早期誘導を可能にするか否か検証したい。

申请人发现，印记基因的DNA甲基化是根据卵母细胞大小而建立的，并且这种卵母细胞特异性DNA甲基化对于受精后的正常个体发育至关重要。因此，如果能够在尚未建立基因组印记的未成熟卵母细胞中强制表达对于建立基因组印记而言必需的DNA甲基转移酶基因Dnmt3a和Dnmt3L，则可以生产孤雌动物。将是一种非常有效的生殖细胞利用技术。因此，在本研究中，我们尝试使用以GFP构建的表达载体作为报告基因，通过电穿孔将基因导入新生儿非生长卵母细胞中。电穿孔非生长卵母细胞的表达载体导入效率和细胞活力受三个因素影响：电刺激条件、缓冲液类型和细胞浓度。电穿孔期间的最佳细胞浓度为 5.0 至 10.0 x 10^5 个细胞/100 μl。此外，在测试22种电刺激程序时，在最佳条件下，导入效率为2.6%，存活率为20.9%，导入卵母细胞的GFP持续强表达一周以上。然而，NIH3T3等体细胞系的基因转移效率和存活率均超过80%，远高于生殖细胞。接下来，我们构建了一个在 GFP 下游插入 IRES 序列和 Dnmt3L 的表达载体，并尝试通过电穿孔将其导入卵母细胞中。结果，以GFP为指标的导入效率显着降低，但通过RT-PCR进行导入处理后的基因表达分析时，观察到外源Dnmt3L的表达。未来，我们希望验证 Dnmt3L 在非生长卵母细胞中的强制表达是否能够早期诱导卵母细胞特异性 DNA 甲基化。