スーパースピードコンジェニック法の新展開

超高速同类方法新进展

基本信息

批准号：
16700349
负责人：
尾畑やよい
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでの申請者らの知見で、インプリント遺伝子のDNAメチル化は卵母細胞のサイズに依存して確立していくこと、この卵子特異的なDNAのメチル化が受精後の正常な個体発生に必須であることが示されてきている。そのため、ゲノミックインプリンティングの確立に不可欠なDNAメチル基転移酵素遺伝子、Dnmt3aやDnmt3Lをゲノミックインプリンティングの確立していない未成長な卵母細胞で強制発現させることができれば、単為発生動物の生産も含め、非常に有効な生殖細胞利用技術になるものと考えられた。そこで本研究では、GFPをレポーター遺伝子として構築された発現ベクターを用い、エレクトロポーレーション法による新生仔非成長期卵母細胞への遺伝子導入を試みた。エレクトロポーレーションによる非成長期卵母細胞の発現ベクター導入効率および細胞生存率は、電気刺激の条件、緩衝液の種類および細胞濃度の3要因によって影響を受けた。エレクトロポーレーション時の細胞濃度は、5.0〜10.0×10^5個/100μlが最も良かった。また、22種類の電気刺激プログラムを試験したところ、最も良い条件では、導入効率2.6%および生存率20.9%となり、卵母細胞に導入されたGFPは、1週間以上強発現し続けた。しかし、NIH3T3などの体細胞株における遺伝子導入効率や生存率は共に80%以上と生殖細胞に比べて格段に高かった。次いで、GFPの下流にIRES配列とDnmt3Lを挿入した発現ベクターを構築し、エレクトロポーレーションにより卵母細胞への導入を試みた。その結果、GFPを指標とした導入効率は顕著に低下したが、導入処理後の遺伝子発現解析をRT-PCRにより行ったところ、外来性Dnmt3Lの発現が認められた。今後は非成長期卵母細胞におけるDnmt3L強制発現が、卵子特異的なDNAメチル化の早期誘導を可能にするか否か検証したい。

申请人的先前发现表明，建立印迹基因的DNA甲基化取决于卵母细胞的大小，并且这种欧米茄特异性的DNA甲基化对于受精后正常的个体发育至关重要。 Therefore, if DNA methyltransferase genes, Dnmt3a and Dnmt3L, which are essential for the establishment of genomic imprinting, can be forced to express in ungrown oocytes that have not yet been established of genomic imprinting, it was thought to be a very effective germ cell utilization technique, including the production of parthenogenetic animals.因此，在这项研究中，我们尝试使用用GFP作为报告基因的表达矢量将基因通过电穿孔转移到新生儿非增生卵母细胞中。通过电穿孔的非生长卵母细胞的表达载体转移和细胞活力的效率受三个因素的影响：电刺激条件，缓冲液类型和细胞浓度。电穿孔过程中最好的细胞浓度为5.0-10.0×10^5细胞/100μL。此外，测试了22个电刺激程序，在最佳条件下，转导效率为2.6％，存活率为20.9％，而引入卵母细胞的GFP继续高度表达了一个多星期。然而，诸如NIH3T3等体细胞系的基因转移效率和存活率都高于80％，这显着高于生殖细胞。接下来，构建了一个表达矢量，其中将IRES序列和DNMT3L插入GFP的下游，然后通过电穿孔将其引入卵母细胞中。结果，使用GFP作为指标的转移效率显着降低，但是通过RT-PCR进行了诱导后的基因表达分析，并且观察到外源DNMT3L。将来，我们想研究非生长卵母细胞中DNMT3L强迫表达是否允许早期诱导卵母细胞中的卵母细胞。