遺伝子、及び固体レベルでのCキナーゼ分子種の組織特異性の解析

个体水平上 C 激酶分子种类的基因和组织特异性分析

基本信息

批准号：
05770087
负责人：
長田真一
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05770087/
关键词：
プロテインキナーゼC 組織特異性精巣プロモーター領域

项目摘要

1.本研究において我々は、様々な分化段階の細胞から成る精巣をモデルにして、細胞の増殖、分化といった段階に異なったPKC分子種が関与するのではないか、という仮説の検証を試みた。まず、ノーザンブロット解析の結果、PKC分子種の中でnPKCdeltaとnPKChthetaの発現が精巣において非常に高いことが分かった。また、両分子種の精巣におけるmRNAの大きさは、他の臓器のそれに比べて小さく、精巣特異的スプライシング機構の存在が示唆された。PCR法を用いて精巣由来のnPKCdelta,thetaのcDNAをクローニングして調べたところ、両分子種共に蛋白コード領域は短くなっておらず、mRNAのサイズが小さくなっているのは、蛋白非コード領域のスプライシングによるものと考えられた。nPKCdeltaは、in situハイブリダイゼーションの結果、減数分裂後の前期精子細胞に特異的に発現が認められた。エルトリエーターで精巣の構成細胞を分画した後のノーザンブロットでも同様の結果が得られた。従って、nPKCdeltaは精巣において半数体特異的に発現していることが示唆された。一方nPKCthetaは、theta特異的抗体を用いて免疫組織染色を行ったところ、アンドロゲンを分泌する間質細胞、ライディッヒ細胞特異的に強い染色が見られた。精巣におけるステロイドホルモンの合成にPKCが関与しているという報告があり、今後ライディッヒ細胞の培養細胞を用いて、nPKCthetaとステロイドホルモンの合成の関係について調べていく予定である。2.PKC分子種の組織特異的発現機構を解析するために、これまで我々が上皮組織での発現が高いことを示してきたnPKCetaの5'上流のゲノムDNAのクローニングを試みた。その結果、5'上流のプロモーター部分を含む領域のクローニングに成功し現在解析中である。

1. 在本研究中，我们尝试使用睾丸作为由不同分化阶段的细胞组成的模型来检验不同的 PKC 分子种类参与细胞增殖和分化阶段的假设。首先，Northern印迹分析显示，在PKC分子种类中，nPKCdelta和nPKChtheta在睾丸中高表达。此外，睾丸中两种分子的 mRNA 大小均小于其他器官中的 mRNA 大小，表明存在睾丸特异性剪接机制。当使用PCR方法克隆和研究睾丸来源的nPKCdelta和theta cDNA时，这两种分子的蛋白质编码区都没有缩短，并且较小的mRNA大小是由于蛋白质非编码区所致。是由于拼接造成的。原位杂交的结果是，nPKCdelta 在减数分裂前期精子细胞中特异性表达。使用淘析器分离睾丸组成细胞后，通过 Northern blotting 获得了类似的结果。因此，表明nPKCδ在睾丸中单倍体特异性表达。另一方面，当使用theta特异性抗体对nPKCtheta进行免疫组织学染色时，在Leydig细胞（分泌雄激素的间质细胞）中特异地观察到强染色。有报道称 PKC 参与睾丸中类固醇激素的合成，我们计划利用培养的 Leydig 细胞研究 nPKCtheta 与类固醇激素合成之间的关系。 2.为了分析PKC分子种类的组织特异性表达机制，我们尝试克隆了nPKCeta的5'上游基因组DNA，我们之前已经证明nPKCeta在上皮组织中高表达。结果，我们成功克隆了包含5'上游启动子部分的区域，目前正在对其进行分析。