セミインタクト細胞とGFP可視化解析を用いた小胞体ストレス応答機構の解明

使用半完整细胞和 GFP 可视化分析阐明内质网应激反应机制

基本信息

批准号：
05J10746
负责人：
田中亜路
金额：
$ 2.11万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

研究代表者はこれまでに膜タンパク質の細胞形質膜への輸送・ターゲティングおよび分解過程をGFP可視化し、これらの動態・輸送キネティクスなどを定量的に解析する顕微アッセイシステム(セミインタクト細胞システム〉を構築した。すなわち、形質膜上に輸送された膜タンパク質が分解を受けるまでの動態をリアルタイムで追跡するための系の確立をおこなってきた。研究代表者はこの系を用い、コレステロールトランスポーター-ABCA1で発見された遺伝病由来の変異膜タンパク質を数種類作成し、GFP可視化解析をおこなった。その結果、Q597R変異体は小胞体ストレスに応じゴルジ体を経て形質膜へ輸送される現象を見出し、当該年度にその詳細を報告した。通常、小胞体における膜タンパク質は小胞体から細胞質に排出され直接分解されると報告されているが、今回の報告はこれと並立する新たな恒常性維持機構の存在を示唆する現象といえる。Q597R変異体(以下QR)は通常状態では、小胞体関連分解(ER associated degradation : ERAD)により分解されているが、小胞体ストレス刺激に応じゴルジ体に到達し、その後形質膜まで達した。この輸送経路についてより詳細に解析したところ、ER exit site及びERGICを経由してゴルジ体に到達するという他の膜タンパク質と同様の経路を経ていることが判明した。また、この輸送と同期して糖鎖付加を受けていることも発見し、QRが細胞からは正規にフォールディングされたタンパク質として認識されていることを明らかにした。また研究代表者は、QR同様に小胞体ストレス刺激により輸送を開始するタンパク質であるATF6とその輸送キネティクスを比較したところ、QRの輸送がATF6よりも早くおこることを明らかにした。ATF6は小胞体ストレス応答に関与するタンパク質であるので、この早い応答は輸送それ自体が細胞の小胞体ストレスに対する抵抗反応であるという可能性を示唆するものである。

研究人员先前已经构建了一个微观测定系统（半独立细胞系统），该系统可视化基于GFP的转运，靶向和降解过程，将膜蛋白的转移过程和降解过程可视化到质膜，并定量分析这些动力学和运输动力学。换句话说，他们建立了一个系统，该系统跟踪运输到质膜上的膜蛋白的动力学直至降解。研究人员使用该系统使用胆固醇转运蛋白ABCA1发现的遗传疾病。产生了突变膜蛋白的几种变体，并进行了GFP可视化。结果，发现Q597R突变体通过高尔基体响应内质网应激，将Q597R突变体通过高尔基体运输到质膜，并在今年报告了细节。通常据报道，内质网中的膜蛋白从内质网中排泄到细胞质中并直接降解，但该报告表明存在稳态维持的新机制，同时发生。 Q597R突变体（以下称QR）处于正常状态，并且内质网相关降解（ER），尽管它因相关降解（ERAD）降解（ERAD），但它响应于内质网应力而到达高尔基体，然后到达肾上腺骨膜骨膜。对该传输路径的更详细的分析表明，它经历了类似于其他膜蛋白的途径，该途径通过ER出口部位和ERGIC到达高尔基体。它还发现它与该转运同步进行糖基化，表明QR被细胞识别为正常折叠蛋白。研究人员还比较了ATF6，该蛋白是通过质疑胁迫刺激开始运输及其转运动力学（如QR中）的蛋白质，并揭示了QR转运比ATF6早。由于ATF6是参与ER应力反应的蛋白质，因此这种早期响应表明运输本身是对细胞ER应激的抗性反应。