NK4産生細胞封入マイクロカプセルを用いた膵癌の新規治療法の開発

使用封装 NK4 产生细胞的微胶囊开发胰腺癌新治疗方法

基本信息

批准号：
05J09329
负责人：
青柳靖之
金额：
$ 2.18万
依托单位：
University of Tsukuba (2006-2007)Osaka University (2005)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J09329/
关键词：
NK4 マイクロカプセル細胞封入

项目摘要

これまでHepatocyte Growth Factor (HGF)とその受容体であるc-Metの関係をブロックする治療物質としてNK4を用いてきたがこれは癌細胞の増殖を抑制する静細胞的な効果物質である。更なる治療効果を上げるために積極的に細胞を殺す殺細胞効果のある物質の開発を考案した。c-Metとの結合部位であるNK4のN端配列の一部(NK1)と緑膿菌外毒素(PE)の一部を結合させた融合タンパク(NK1-PE)の作製を行った。NK4プラスミドのNK1配列とIL13-PEプラスミドのIL13配列を組み替える事によりNK1-PEのコンストラクトを作製した。タンパク発現をlmM IPTG、37℃で3時間誘導を行い、不溶性に発現したタンパクを回収した後リフォールディング、FPLCによる精製を行ったが収量を増やす事は困難であった。次に収量を増やす為に上記で作製したコンストラクトのNK1-PE部分をpGEX-2Tベクターに組み込む事によりGSTタグを融合させたタンパクの作製を試みた。また宿主の菌はOrigami株を用いた。タンパク発現を0.lmM IPTG、24℃で一晩誘導する事により可溶性に発現する事ができた。このタンパクをグルタチオンセファロースに結合後、トロンビンによりGSTを切断して回収する事で問題を改善する事ができた。in vitroにて膵癌細胞にNK1-PEを添加し(0.1ng/ml〜100μg/ml)、72時間後に生死細胞の評価を行った。c-Metが高発現しているSUIT-2、 AsPc-1での殺細胞効果は決して高くなく、低発現のしているBxPc-3やMiaPaca-2である程度の殺細胞効果が認められた。これは作製したNK1-PEがこれまで報告されているNK4が血管新生を抑制する経路上のc-Met以外の細胞表面上に発現している受容体に結合しPEの作用により死滅した可能性が示唆された。

迄今为止，NK4已被用作阻断肝细胞生长因子（HGF）与其受体c-Met之间关系的治疗物质，并且是抑制癌细胞增殖的细胞生长抑制物质。为了进一步提高治疗效果，我们设计开发了一种主动杀死细胞的细胞杀伤物质。我们创建了一种融合蛋白（NK1-PE），其中 NK4（NK1）的 N 端序列（c-Met 的结合位点）的一部分与铜绿假单胞菌外毒素（PE）的一部分相结合。通过重组 NK4 质粒的 NK1 序列和 IL13-PE 质粒的 IL13 序列创建 NK1-PE 构建体。 1mM IPTG 37℃诱导蛋白表达3小时，回收不溶的表达蛋白，重折叠，FPLC纯化，但产量难以提高。接下来，为了提高产量，我们尝试通过将上面创建的构建体的 NK1-PE 部分整合到 pGEX-2T 载体中来创建与 GST 标签融合的蛋白质。此外，Origami菌株被用作宿主细菌。通过用 0.lmM IPTG 在 24°C 过夜诱导蛋白质表达来实现蛋白质的可溶性表达。将该蛋白与谷胱甘肽琼脂糖凝胶结合后，我们能够通过用凝血酶裂解并回收 GST 来改善该问题。将 NK1-PE 添加到体外胰腺癌细胞中（0.1 ng/ml 至 100 μg/ml），72 小时后评估活细胞和死细胞。 c-Met 高表达的 SUIT-2 和 AsPc-1 的细胞杀伤效果并不高，而 c-Met 低表达的 BxPc-3 和 MiaPaca-2 的细胞杀伤效果则较差。有一定的细胞杀伤作用。这可能是由于制备的NK1-PE可能与除c-Met之外的细胞表面表达的受体结合，而c-Met是之前报道的NK4抑制血管生成的途径，并被PE的作用杀死。建议。