Fas抗原の生理作用とその情報伝達機構の解析

Fas抗原的生理效应及其信息传递机制分析

基本信息

批准号：
05152142
负责人：
長田重一
金额：
$ 6.4万
依托单位：
Osaka Bioscience Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05152142/
关键词：
Fas Fasリガンドアポトーシス情報伝達サイトカイン受容体細胞死

项目摘要

動物の発生,分化過程において数多くの細胞が死ぬべく予定されており,その細胞死はアポトーシス(apoptosis)と呼ばれる機構で進行する。アポトーシスは細胞質,核の凝縮を伴い,また生化学的にはDNAの断片化を伴う過程である。ところでFasはTNF/NGF受容体群に属し,そのアゴニストとして作用する抗体は細胞のアポトーシスを誘導する。このことから,Fasは“Death factor"の受容体と考えられた。本研究はFasの本来のリガンドを同定するとともに,Fasを介したアポトーシスの情報伝達機構の解析を目的とした。まず,Fasの細胞外領域をヒトイムノグロブリンH-鎖と融合したキメラ遺伝子を構築し,動物細胞で発現し,精製した。このキメラタンパク質(mFas‐Fc)を用いて種々の細胞株を検討した結果,細胞障害性T-細胞株(CTL)であるPC60‐d10Sにおいて,Fasリガンドを発現することが認められ,かつそのCTL活性はmFas‐Fcにより阻害された。そこでd10s細胞のFACSを用いたsortingを16回繰り返すことにより,Fasリガンドをd10Sに較べ100倍大量に発現するサブラインd10S16株を樹立した。ついでこの細胞株を大量に培養し,その膜分画よりFasリガンドを分子量約4万の単一タンパク質として精製した。ついでd10S株よりcDNAライブラリーを作製し,発現クローニング法によりFasリガンドcDNAを単離した。そのアミノ酸配列から,FasリガンドはTNFと相同性を持つタイプII膜タンパク質であることが示された。一方,COS細胞を用いて発現させた組み換えFasリガンドはFasに結合し,アポトーシスにより細胞を死滅させた。この結果は,Fasリガンドは“a death factor"でありFasはその受容体であることを示している。また,FasリガンドcDNAを用いたNorthern hybridizationの解析から,Fasリガンドは活性化されたT-リンパ球での発現が認められ,CTLにおけるFasの寄与が明らかとなった。

在动物的发育和分化过程中，许多细胞都会死亡，细胞死亡是通过一种称为细胞凋亡的机制进行的。细胞凋亡是一个涉及细胞质和细胞核浓缩以及 DNA 断裂的生物化学过程。顺便说一句，Fas属于TNF/NGF受体组，作为其激动剂的抗体会诱导细胞凋亡。由此看来，Fas被认为是“死亡因子”的受体。本研究的目的是鉴定Fas的原始配体并分析Fas介导的细胞凋亡信号传递机制。首先，构建了Fas胞外区与人免疫球蛋白H链融合的嵌合基因，并在动物细胞中表达并纯化。使用该嵌合蛋白（mFas-Fc）检查各种细胞系的结果发现，细胞毒性T细胞系（CTL）PC60-d10S表达Fas配体，并且CTL的活性被mFas抑制-Fc。因此，通过使用FACS重复分选d10s细胞16次，我们建立了亚系d10S16菌株，其表达Fas配体的量是d10S的100倍。然后大量培养该细胞系，并从膜组分中纯化出 Fas 配体，作为分子量约为 40,000 的单一蛋白质。然后从d10S菌株构建cDNA文库，并通过表达克隆分离Fas配体cDNA。其氨基酸序列表明Fas配体是与TNF同源的II型膜蛋白。另一方面，使用COS细胞表达的重组Fas配体与Fas结合并通过凋亡杀死细胞。这一结果表明Fas配体是“死亡因子”，Fas是其受体。此外，使用Fas配体cDNA的Northern杂交分析表明，Fas配体在活化的T淋巴细胞中表达，揭示了Fas对CTL的贡献。