蛍光性核酸塩基検出試薬を利用した簡素な一塩基多型検出法の開発と応用

荧光核碱基检测试剂简单单核苷酸多态性检测方法的开发与应用

• 批准号: 05J04798
• 负责人: 佐竹 弘行
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J04798/
• 关键词: 一塩基多型; 蛍光性小分子リガンド; 脱塩基部位; 疎水場蛍光プローブ; 蛍光発光応答; 蛍光レシオ検出; 表面プラズモン共鳴; 蛍光性有機小分子リガンド

DNA中の一塩基多型の新たな検出方法として、所属研究グループでは脱塩基部位(AP site)含有DNAプローブと蛍光性小分子リガンドを併用する検出法を提案している。本年度は、疎水場蛍光プローブであるDBD(7-N, N-Dimethylaminosulfonylbenzo-2-oxa-1,3-diazole)をAMND(2-Amino-7-methyl-1,8-naphthyridine)に導入したリガンドを新規に開発した。このリガンドとAP site含有DNA二重鎖との相互作用を評価したところ、ターゲット塩基がシトシン、チミンの場合にDBDが著しい蛍光発光応答を示した。またこれにピリミジン塩基に対して蛍光消光応答を示すAMND部位の応答を組み合わせ、蛍光強度に応じた擬似カラー表示による蛍光レシオ検出を行ったところ、ピリミジン塩基とプリン塩基の明瞭な視覚的判別が可能であった。このDBDの発蛍光応答は、DBD部位周辺の疎水性の増加によるものと考えられる。すなわち、ターゲット塩基がピリミジン塩基の場合には、AMND部位がAP site内で塩基を認識するのに伴い、DBD部位がDNA二重鎖の疎水場である副溝に位置するという仕組みである。そこで、DBDの蛍光ストークスシフトの変化からLippert-Matagaの式等を利用してこの場合のリガンドのDBD部位周辺の誘電率を調べた結果、副溝に位置していることを示唆する値を示した。さらに、DNA二重鎖に比べて副溝の疎水性が低いDNA-RNA二重鎖にこのリガンドを適用したところ、DBDの発光応答は減少し、DBD部位が副溝側に位置していることを示す結果を得た。また、表面プラズモン共鳴を利用する検出法について、最適な測定条件を検討し、PCR産物に対する検出への応用を行った。その結果、107merDNA中の一塩基変異の明瞭な検出を達成した。

作为检测DNA中单核苷酸多态性的新方法，我们的关联研究小组提出了一种检测方法，其中使用含有无碱位点的DNA探针和荧光小分子配体组合使用。今年，我们开发了一种新的配体，其中将DBD（7-N，N-二甲基氨基磺基伦替伦替伦替氏-2-OXA-1,3-唑）（将疏水性场荧光探针）引入AMND（2-Amino-amino-7-氨基-7-氨基-1-氨基-1,8-北硫代噻吩吡啶）。当评估该配体与AP位点DNA双链体之间的相互作用时，当目标碱是胞嘧啶和胸腺氨酸时，DBD显示出明显的荧光反应。此外，当将AMND位点的响应与AMND位点的响应结合在一起时，AMND位点的荧光淬灭反应与AMND位点的响应结合在一起，并且根据荧光强度通过模拟颜色显示，可检测到荧光比，可明显地视觉上歧视嘧啶基碱和puriine碱基础。 DBD的这种荧光反应被认为是由于DBD位点周围疏水性的增加所致。也就是说，当目标基碱是嘧啶碱基时，机制是，当AMND位点识别AP位点内的基部时，DBD位点位于次要凹槽中，该凹槽是DNA双链的疏水场。因此，基于DBD的荧光Stokes偏移的变化，我们使用Lippert-Mataga方程等研究了配体DBD位点周围的介电常数，并显示了一个值，表明它位于小凹槽中。此外，当将这种配体应用于DNA-RNA双链体时，在小凹槽中的疏水性较低，而DNA双链体的疏水性较低时，DBD的发光响应减少了，表明DBD位点位于次要凹槽方面。此外，研究了使用表面等离子体共振的最佳测量条件以进行检测方法，并将该方法应用于PCR产物的检测。结果，实现了107mer DNA中单核苷酸突变的清晰检测。

项目成果

Ratiometric fluorescence detection of pyrimidine/purine transversion by using a 2-amino-1,8-naphthyridine derivative

使用 2-氨基-1,8-萘啶衍生物比率荧光检测嘧啶/嘌呤转换

• 发表时间: 2006
• 期刊: Anal.Sci. 22・2
• 作者: Y.Chen;A.Yamaguchi;T.Atou;K.Morita;N.Teramae;S.Nishizawa 他3名;A.Yamaguchi 他4名;H.Satake 他2名
• 通讯作者: H.Satake 他2名