メタン発酵微生物共生系における微生物間相互作用の分子遺伝学的解析

甲烷发酵微生物共生系统中微生物相互作用的分子遗传学分析

基本信息

批准号：
05J00167
负责人：
中村浩平
金额：
$ 1.41万
依托单位：
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

1.単独培養、共培養条件下での・H株のプロテオミクス▽共培養条件下の・H株の性状解析▲共培養条件下特異的発現タンパク質群の同定・発現量およびmRNA発現の解析異なる共生基質・水素発生型共生菌との共培養系を確立し、それら共培養系においてΔH株の遺伝子発現を2次元電気泳動およびメタン合成遺伝子群のmRNA発現を定量PCRで解析した。その結果、いかなる共生状態においても特異的に高発現する遺伝子を見出した。2.・H株の遺伝子操作系の構築▽ベクターの開発▲マーカーの選択(カナマイシン、ピューロマイシン、プリン体アナログ等)ピューロマイシン、カナマイシンがマーカーとして最適であることを見出し、ΔH株の至適生育温度に適した耐性遺伝子マーカーをもつプラスミドの構築を試みた。カナマイシンの耐熱耐性遺伝子をもつ遺伝子破壊プラスミドの構築を行った。Thermus thermophilusを用いてピューロマイシン耐性遺伝子の耐熱化を試みた。その結果、ピューロマイシン耐性遺伝子の耐熱化は困難であり、耐熱性カナマイシン耐性遺伝子を用いた遺伝子破壊プラスミドを実験に用いることにした。▽形質転換系の確立▲遺伝子導入法の確立リボソーム媒介法による上記遺伝子破壊プラスミドの形質転換を試みた。リボソームの検討、ΔH株プロトプラスト細胞との融合時間、リボソームとDNA量比等種々の条件検討を行った。▽・H株の寒天平板培地での簡易コロニー形成法の開発▲共培養パートナーの選択(従属栄養性高温性好気性(通性嫌気性)細菌)▲共培養条件の確立ΔH株の簡易平板培養法を構築した。本手法は様々な硫酸還元菌、メタン生成菌、水素発生型共生菌といった絶対嫌気性際微生物の培養に適用可能であることを明らかとし、その成果を,日本微生物生態学会、国際微生物生態学会で発表した。

1。菌株H在单培养和共培养条件下的蛋白质组学；共培养条件下菌株H的性质分析；在共培养条件下特有表达的蛋白质的鉴定和表达水平；分析在共培养条件下特有蛋白质表达的蛋白质的mRNA表达。通过不同的共生底物和氢生成共生细菌建立共培养系统，并通过定量PCR分析了这些共培养系统中ΔH菌株的基因表达。结果，发现了在任何共生状态中高度表达的基因。 2。构建用于应变H的遗传工程系统的媒介开发▲选择标记物（卡纳米霉素，嘌呤霉素，嘌呤类似物等），我们发现紫霉素和卡纳霉素是最好的标记物，并试图用抗抗性基因标记物构建适合于应变δH的抗抗性基因的质粒。构建了带有卡纳霉素耐热基因的基因破坏质粒。嗜热菌用于耐热基因。结果，在实验中使用了使用耐热kanamycin耐药基因的基因破坏质粒，因此很难使嘌呤霉素耐药性基因抗性。 ▽试图通过核糖体介导的方法建立上述基因破坏质粒的基因转移方法转化的建立。检查了各种疾病，包括核糖体，与ΔH菌株原生质体细胞融合的时间以及核糖体与DNA含量之比。 ▽・开发了琼脂板培养基中菌株H的简单菌落形成方法▲选择共培养伙伴（异养高温有氧运动（兼性厌氧）细菌）▲建立了共培养物条件的一种简单的平原方法，用于构建用于二δH菌株的平原方法。该方法已被证明适用于绝对厌氧微生物的培养，例如各种硫酸盐还原细菌，甲烷造成细菌和产生氢的共生细菌，并且在日本微生物生态学和微生物生态学的国际生态学学会上呈现了结果。