新しい甲状腺刺激ホルモンα2β5(サイロスティムリン)のELISA開発と糖鎖解析

新型促甲状腺激素α2β5（促甲状腺素）的 ELISA 开发和聚糖分析

• 批准号: 16790953
• 负责人: 中林 幸士
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790953/
• 关键词: α2; β5; サイロスティムリン; α2; β5; サイロスティムリン

LH, FSH, TSHのαサブユニットとβサブユニットに類似した新しい2つの糖タンパクである第2のαサブユニット(α2)と第5のサブユニット(β5)をヒト下垂体cDNAライブラリーより発見した。α2とβ5は互いにヘテロダイマーを形成してTSH受容体を刺激することを認め、この新しい糖タンパクホルモンをサイロスティムリンと命名した(J Clin Invest 109:1445-52,2002)。本研究では、α2及びβ5に対する抗体作成及び糖鎖・シスチンノットのダイマー形成能や分泌能に及ぼす影響を検討するのが目的である。まず、抗体作成のために、α2及びβ5に対する精製したGST-fusion proteinを作成した。PGEX 4T1ベクターにα2及びβ5を組み込み、ベクターをBL21に形質導入した。形質導入した細胞にIPTGを添加することで蛋白を発現させ、細胞内よりソニケーターで抽出した。抽出した蛋白をGSTカラムにかけ精製した。抗原として必要な約10mgの精製した蛋白を作成した。α2及びβ5をウサギに免疫したが、抗体価の高いバッチを選択し、immunoblottingしたが、良質な抗体は得られなかった。次に、糖鎖・シスチンノットのダイマー形成能や分泌能に及ぼす影響を検討するため、α2及びβ5の変異体を作成した。オーバーラッピングPCRを用い、糖鎖結合部位のアスパラギン及びシスチンノットを形成するシステインをアラニンへ変異させ糖鎖を切断したα2 cDNAとβ5 cDNA、シスチンノットを切断したα2 cDNAとβ5 cDNAを作成し、変異をシークエンスにより確認した。続いて、変異を入れたα2 cDNAとβ5 cDNAを293t細胞に形質導入し、cell lineを作成した。

从人类垂体cDNA文库中发现了两个与LH，FSH和TSH的α和β亚基相似的新糖蛋白，第二个α亚基（α2）和第五亚基（β5）。我们发现α2和β5彼此形成异二聚体以刺激TSH受体，而这种新的糖蛋白激素被命名为thyrostimulin（J Clin Invest 109：1445-52,2002）。这项研究的目的是开发针对α2和β5的抗体，并研究聚糖和胱氨酸结对二聚体形成和分泌能力的影响。首先，为α2和β5制备纯化的GST融合蛋白用于抗体产生。将PGEX 4T1载体与α2和β5合并，并将载体转导为BL21。通过将IPTG添加到转导的细胞中，并用超声源从细胞内提取来表达蛋白质。提取的蛋白在GST柱上纯化。制备了大约10 mg纯化的蛋白质，这是抗原所需的。用α2和β5对兔子进行免疫，但是选择了具有高抗体滴度的批次并进行免疫印迹，但没有获得优质抗体。接下来，为了研究聚糖胱氨酸结对二聚体形成和分泌能力的影响，制备了α2和β5的突变体。使用重叠的PCR，将α2和β5cDNA突变为在糖链结合位点上的天冬酰胺，半胱氨酸与丙氨酸形成胱氨酸结，以产生α2和β5cDNA，α2和β5cDNA，α2和β5cDNA，这些cDNA已被裂解，并通过序列确认了突变。随后，用突变的α2和β5cDNA转导293T细胞以产生细胞系。