中枢神経細胞におけるCaM kinase kinaseの活性動態と機能

中枢神经细胞CaM激酶激酶的活性动态和功能

基本信息

批准号：
15700283
负责人：
笠原二郎
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

カルシウム/カルモデュリン(Ca/CaM)依存性プロテインキナーゼカスケードは、CaMKI,CaMKIVおよびそれらの活性化酵素であるCaMKKにより構成され、中枢神経では神経活動に伴った軸索伸展調節や遺伝子発現調節などに関与すると考えられる。CaMKKにはαとβの2つのアイソフォームが存在するが、その細胞内分布や機能に関する詳細な報告は少ない。私はラット培養海馬神経細胞を用いて、CaMKKαが細胞質と核の両方に、一方βは細胞質のみに存在していることを、(1)活性の測定、(2)免疫ブロット、(3)免疫染色、以上3つの手法により明らかにした。(1)組み換えCaMKI変異体を作成し、これをCaMKK活性測定用基質とした。培養海馬神経細胞を破砕し、細胞質と核それぞれの抽出液を得、それぞれに含まれるCaMKKのCa依存性および非依存生活性を測定した。その結果、細胞質分画からはCa依存性および非依存性両方の活性が、核分画からはCa依存性活性のみが検出された。またそれぞれのCa依存性活性はグルタミン酸刺激により変化しなかったが、細胞質のCa非依存性活性は刺激により統計上有意な増加を示した。COS7細胞にCaMKKαおよびβアイソフォームをそれぞれ発現させて、その細胞抽出液中のCaMKK活性を測定したところ、CaMKKα発現細胞の抽出液にはCa依存性活性のみが、β発現細胞抽出液からはCa依存性及び非依存性両方の活性が検出された。(2)上記(1)において得られたラット培養海馬神経細胞の細胞質及び核抽出液に対し、CaMKKα及びβのポリクローナル抗体を用いて免疫ブロットを行った。その結果、αは細胞質と核の両方より、またβは細胞質のみから免疫反応性が得られた。またグルタミン酸刺激によって、各分画におけるそれぞれの相対量は変化しなかった。(3)メタノール固定した培養海馬神経細胞に対し、(2)で用いたポリクローナル抗体によって免疫染色を行った。CaMKKαの免疫反応性は細胞質と核の両方から、CaMKKβは細胞質のみから検出された。(まとめ)以上の結果より、ラット培養海馬神経細胞において、Ca依存性活性のみを示すCaMKKαは細胞質と核の両方に、またCa依存性及び非依存性活性の両方を示すCaMKKβは細胞質にのみ存在することが示された。細胞質には主としてCaMKIが、核にはCaMKIVがそれぞれ存在することが報告されており、CaMKKアイソフォームの分布の相違は、活性化する下流の酵素の相違を生み出している可能性を示唆している。以上の結果の一部は現在、論文投稿準備中である。

钙/钙调蛋白（CA/CAM）依赖性的脉冲激酶级联反应由CAMKI，CAMKIV及其活化酶组成。 CAMKK具有两种同工型α和β，但几乎没有有关细胞内分布和功能的详细报告。 I使用大鼠培养物和海马神经细胞，并且CAMKKα在细胞和细胞核中均存在，而β仅在细胞质中存在，（1）活性的测量，（2）免疫印迹，（3）上述三种方法。揭示。（1）创建了重组CAMKI突变体，并用作CAMKK活性测量的底物。粉碎了培养和海马神经细胞，获得了每个细胞的细胞和提取的溶液，并测量了每个细胞的CA依赖性和非依赖性寿命。结果，仅从细胞质结构中检测到CA和非依赖性的活性，并且仅从核分裂中检测到CA依赖性活性。每种Ca依赖性活性并未因谷氨酸刺激而变化，但是通过刺激刺激了细胞质的Ca非依赖性活性。在COS7细胞中表达CAMKKα和β-异构体，并测量细胞提取物中的CAMKK活性。（2）使用CAMKKα和β多克隆抗体在上述（1）中获得的大鼠培养神经细胞的细胞原和核提取物进行了免疫印迹。结果，从细胞质和细胞核中获得α，仅从细胞质中获得β。同样，谷氨酸刺激不会改变每个部分每个部分的相对量。（3）通过（2）中使用的多克隆抗体对甲醇固定培养和海马神经细胞进行免疫。从细胞质和细胞核中都检测到CAMKKα的免疫反应，仅从细胞质中检测到CAMKKβ。（摘要）从上述结果中，在大鼠培养物和海马神经细胞中，CaMKKα仅表明Ca依赖性活性，仅在细胞质细胞中，这表明CAT和Nuclei既表明CAT和Nuclei，ca cat and Nuclei，ca依赖性和非依赖性活性。证明是这样做的。据报道，CAMKI主要在细胞源性和CAMKIV中，表明CAMKK同工型的差异可能会在活化的下游酶中造成差异。目前正在准备上述一些结果来发布论文。

项目成果

期刊论文数量（6）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Expression and phosphorylation of δ-CaM Kinase II in cultured Alzheimer skin fibroblasts.

培养的阿尔茨海默皮肤成纤维细胞中 δ-CaM 激酶 II 的表达和磷酸化。

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
Neurobiology of Aging 25(9)
影响因子：
0
作者：
Cavazzin;C.;Bonvicini;C.;Nocera;A.;Racchi;M.;Kasahara;J.;Tardito;D.;Gennarelli;M.;Govoni;S.;Racagni;G.;Popoli;M.
通讯作者：
M.

Effect of lithium on the circadian rhythms of locomotor activity and GSK-3 protein expression in the mouse suprachiasmatic nuclei.

锂对小鼠视交叉上核运动活动昼夜节律和 GSK-3 蛋白表达的影响。