中枢神経細胞におけるCaM kinase kinaseの活性動態と機能

中枢神经细胞CaM激酶激酶的活性动态和功能

基本信息

批准号：
15700283
负责人：
笠原二郎
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

カルシウム/カルモデュリン(Ca/CaM)依存性プロテインキナーゼカスケードは、CaMKI,CaMKIVおよびそれらの活性化酵素であるCaMKKにより構成され、中枢神経では神経活動に伴った軸索伸展調節や遺伝子発現調節などに関与すると考えられる。CaMKKにはαとβの2つのアイソフォームが存在するが、その細胞内分布や機能に関する詳細な報告は少ない。私はラット培養海馬神経細胞を用いて、CaMKKαが細胞質と核の両方に、一方βは細胞質のみに存在していることを、(1)活性の測定、(2)免疫ブロット、(3)免疫染色、以上3つの手法により明らかにした。(1)組み換えCaMKI変異体を作成し、これをCaMKK活性測定用基質とした。培養海馬神経細胞を破砕し、細胞質と核それぞれの抽出液を得、それぞれに含まれるCaMKKのCa依存性および非依存生活性を測定した。その結果、細胞質分画からはCa依存性および非依存性両方の活性が、核分画からはCa依存性活性のみが検出された。またそれぞれのCa依存性活性はグルタミン酸刺激により変化しなかったが、細胞質のCa非依存性活性は刺激により統計上有意な増加を示した。COS7細胞にCaMKKαおよびβアイソフォームをそれぞれ発現させて、その細胞抽出液中のCaMKK活性を測定したところ、CaMKKα発現細胞の抽出液にはCa依存性活性のみが、β発現細胞抽出液からはCa依存性及び非依存性両方の活性が検出された。(2)上記(1)において得られたラット培養海馬神経細胞の細胞質及び核抽出液に対し、CaMKKα及びβのポリクローナル抗体を用いて免疫ブロットを行った。その結果、αは細胞質と核の両方より、またβは細胞質のみから免疫反応性が得られた。またグルタミン酸刺激によって、各分画におけるそれぞれの相対量は変化しなかった。(3)メタノール固定した培養海馬神経細胞に対し、(2)で用いたポリクローナル抗体によって免疫染色を行った。CaMKKαの免疫反応性は細胞質と核の両方から、CaMKKβは細胞質のみから検出された。(まとめ)以上の結果より、ラット培養海馬神経細胞において、Ca依存性活性のみを示すCaMKKαは細胞質と核の両方に、またCa依存性及び非依存性活性の両方を示すCaMKKβは細胞質にのみ存在することが示された。細胞質には主としてCaMKIが、核にはCaMKIVがそれぞれ存在することが報告されており、CaMKKアイソフォームの分布の相違は、活性化する下流の酵素の相違を生み出している可能性を示唆している。以上の結果の一部は現在、論文投稿準備中である。

钙/钙调蛋白（CA/CAM）依赖性蛋白激酶级联反应由CAMKI，CAMKIV及其激活酶CAMKK组成，并被认为与中枢神经系统中的轴突延伸和基因表达有关，并由神经活性伴随。 CAMKK具有两种同工型α和β，但其亚细胞分布和功能的详细报道很少见。使用大鼠培养的海马神经元，我揭示了CaMKKα存在于细胞质和细胞核中，而β仅存在于细胞质中。（1）活性测量，（2）免疫印迹和（3）免疫染色。（1）制备重组CAMKI突变体并用作测量CAMKK活性的底物。培养的海马神经元被破坏以获得细胞质和核的提取物，并测量了每个CAMKK的CA依赖性和独立的生活方式。结果，在细胞质分数中检测到CA依赖性和独立活性，而在核分裂中仅检测到CA依赖性活性。此外，尽管谷氨酸刺激并未改变每种的CA依赖性活性，但细胞质CA独立的活性在刺激上具有统计学上的显着增加。当在COS7细胞中表达CAMKKα和β同工型并测量细胞提取物中的CaMKK活性时，仅在表达CAMKKα的细胞提取物中检测到CA依赖性活性，并且在表达CAMKKα表达细胞的提取物中都检测到CA依赖性和独立活性。（2）使用CAMKKα和β的多克隆抗体在上述（1）中获得的大鼠培养的海马神经元的细胞质和核提取物进行免疫印迹。结果，从细胞质和细胞核中获得α，仅从细胞质获得β。此外，谷氨酸刺激不会改变每个馏分的相对量。（3）用（2）中使用的多克隆抗体免疫染色的甲醇固定培养的海马神经元。在细胞质和细胞核中都检测到CAMKKα的免疫反应性，而仅在细胞质中检测到CAMKKβ。（摘要）上述结果表明，在大鼠培养的海马神经元中，CaMKKα仅表现出CA依赖性活性，在细胞质和细胞核中都存在，并且Camkkβ仅存在于细胞质中。据报道，CAMKI主要存在于细胞质中，Camkiv位于细胞核中，这表明CAMKK同工型分布的差异可能会在激活的下游酶中产生差异。目前正在为提交论文准备上述一些结果。

项目成果

期刊论文数量（6）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Expression and phosphorylation of δ-CaM Kinase II in cultured Alzheimer skin fibroblasts.

培养的阿尔茨海默皮肤成纤维细胞中 δ-CaM 激酶 II 的表达和磷酸化。

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
Neurobiology of Aging 25(9)
影响因子：
0
作者：
Cavazzin;C.;Bonvicini;C.;Nocera;A.;Racchi;M.;Kasahara;J.;Tardito;D.;Gennarelli;M.;Govoni;S.;Racagni;G.;Popoli;M.
通讯作者：
M.

Effect of lithium on the circadian rhythms of locomotor activity and GSK-3 protein expression in the mouse suprachiasmatic nuclei.

锂对小鼠视交叉上核运动活动昼夜节律和 GSK-3 蛋白表达的影响。