ガンマセクレターゼの同定とアミロイドベータタンパク質Aβ42の産生機序

β淀粉样蛋白Aβ42的γ分泌酶鉴定及产生机制

• 批准号: 15700271
• 负责人: 舟本 聡
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15700271/
• 关键词: アルツハイマー; アミロイドベータタンパク質; ガンマセクレターゼ; ガンマ切断; イプシロン切断; APP; プレセニリン; アルツハイマー病

今年度の本研究では、ガンマセクレターゼによるガンマ切断のイプシロン切断依存性を検証するため、予めガンマ切断部位からはじまるAPPカルボキシル末断片(CTF41-99)をCHO細胞に発現させて、イプシロン切断が起こるか否か検討した。その結果、細胞内からγCTFと伺じ移動度の断片が検出され、質量分析の結果CTF50-99であることがわかった。しかし、ガンマセクレターゼ特異的阻害剤(L-685,458)を細胞に処理しCTF50-99の検出を試みると、細胞は処理にも関わらずCTF50-99を産生することがわかった。このことはCTF41-99を発現させて得られたCTF50-99はガンマセクレターゼとは別の機構で生じていることを示し、ガンマセクレターゼによるガンマ切断のイプシロン切断依存性を反証するには到らなかった。以上の結果と昨年の成果を含めた論文がBiochemistry誌に受理された。膜貫通部分の途中までを含むAPPのカルボキシル末端断片(CTF1-51)を細胞に発現させると、Aβ42が顕著に増加しAβ40が減少する。このCTF1-51を発現する細胞をAβ42の産生モデルとし、様々な条件でAβの産生能を調査した。まず、この細胞の膜フラクションを様々な界面活性剤で可溶化し、酵素活性(Aβ産生能)を測定した。通常のCTF1-99を発現する細胞の膜フラクションはDIGITONINで可溶化しても酵素活性を有することはないが、CTF1-51を発現する細胞の場合では酵素活性を有していた。また、産生されるAβ42の割合は依然高いままであった。一方、Blue Native PAGEにより可溶化フラクションを展開し、抗Nicastrin抗体でガンマセクレターゼ複合体を検出したところ、分子量44万に加えて30万〜25万付近にもバンドを検出した。通常のCTF1-99を発現する細胞の可溶化フラクションでは分子量44万のバンドのみ検出されることから、30万〜25万付近に現れるバンドはAβ42の産生に特異的なものと考えられる。

在今年的研究中，为了验证伽马分泌酶对epsilon的伽马裂解的依赖性，我们先前从CHO细胞中的伽马裂解位点开始表达了一个App羧基片段（CTF41-99），以确定是否发生Epsilon裂解。结果，在细胞中检测到迁移率的片段为γCTF，质谱表明它是CTF50-99。但是，当细胞用γ泌尿酶特异性抑制剂（L-685,458）处理并试图检测CTF50-99时，发现尽管治疗了CTF50-99，但仍发现细胞。这表明通过表达CTF41-99获得的CTF50-99是通过与伽马泌尿外酶不同的机制发生的，并且不可能反驳伽马泌尿酶γ裂解的Epsilon裂解依赖性。该论文，包括上述结果和去年的结果，被生物化学杂志接受。 APP的羧基末端片段（CTF1-51）的羧基末端片段（CTF1-51）包含细胞中跨膜部分的中间部分的表达可显着增加Aβ42并降低Aβ40。表达CTF1-51的细胞用作Aβ42产生的模型，并在各种条件下研究了Aβ产生的能力。首先，该细胞的膜分数用各种表面活性剂溶解，并测量酶活性（Aβ产生能力）。即使用digitonin溶解，正常CTF1-99表达细胞的膜分数也没有酶活性，但是对于表达CTF1-51的细胞，它具有酶活性。此外，产生的Aβ42的比例仍然很高。同时，当使用蓝色天然页面开发溶解分数时，用抗静脉抗体检测到伽马泌尿酶配合物，除了440,000的分子量外，在300,000至250,000附近检测到条带。在表达CTF1-99的正常细胞的溶解分数中，仅检测到分子量为440,000的频带，并且认为出现约300,000至250,000的频带被认为是针对Aβ42的生产的特定的。

项目成果

Huang et al.: "Receptor-mediated regulation of P13Ks confines P1(3.4.5) P_3 to the leading edge of chemotaxing cells"Molecular Biology of the Cell. 14・5. 1913-1922 (2003)

Huang 等人：“P13K 的受体介导的调节将 P1(3.4.5) P_3 限制在趋化细胞的前缘”，《细胞分子生物学》14·5 (2003)。

Dictyostelium PAKc is required for proer chemotaxis

盘基网柄菌 PAKc 是促进趋化性所必需的

• 发表时间: 2004
• 期刊: Molecular Biology of the Cell 15・12
• 作者: Shouzhen Xia^*;Tomoyuki Miyashita^*;Tsai-Feng Fu^*;et al. These authors contributed equally ot this work;Yu Katsuyama;Jason Shiotsugu;Susan Lee
• 通讯作者: Susan Lee