窒素に応答したダイズ種子貯蔵タンパク質遺伝子転写調節因子の同定

大豆种子贮藏蛋白基因转录调控因子氮响应的鉴定

• 批准号: 15688003
• 负责人: 大竹 憲邦
• 金额: $ 19.3万
• 依托单位: Niigata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15688003/
• 关键词: ダイズ; 種子貯蔵タンパク質; 転写調節タンパク質; 無機ピロリン酸フォスファターゼ; SEF1; βサブユニット; クロマチンモデリングファクター; SWI; SNF複合体; ダイズ種子; 貯蔵タンパク質; 窒素応答; 上流転写調節領域; フォスファターゼ; ミヤコグサ; 上流転写領域; マクロアレイ

これまでダイズ種子貯蔵タンパク質の一つであるβサブユニットは利用可能なグルタミン濃度により集積量が調節されることを明らかにしてきた。窒素欠乏ダイズに対する高濃度窒素供給が登熟種子の遺伝子発現に与える影響についてミヤコグサマクロアレイを用い網羅的に解析したところ、無機ピロリン酸フォスファターゼが関与している可能性が示唆された。未熟子葉のin vitro培養系において、オルトバナジン酸によりフォスファターゼ活性を阻害し、更に無機リン酸を10mM添加する実験を行ったところβサブユニットmRNA集積はフォスファターゼの活性を阻害していない時と同程度に回復した。従ってダイズ登熟種子では窒素供給量の増加を無機リン酸の生成量で検知しシグナル伝達している可能性が強く示唆された。βサブユニット遺伝子上流プロモータ領域のデリーションラインを用いて転写調節領域における窒素応答領域について解析し、調節領域に結合するタンパク質の同定を行った。前年度までに窒素応答配列は転写開始点-732bpから-631bpまでの101bpの間であることを明らかにしてきた。この領域にはすでにDNA結合タンパク質であるSEF1が認識する配列が報告されているため、SEF1認識配列を含む25bpをタンデムに並べたプライマーを作成し、酵母ワンハイブリッドシステムによりDNA結合タンパク質を検索した。in vitroにおいて明確なタンパク質の発現が認められた一つについてin vitro翻訳産物と合成オリゴペプチドと混合し、ゲルシフトアッセイを行った。その結果、ダイズ未熟子葉の核タンパクを混合した時とほぼ同じ位置にシフトしたバンドが認められ、これがダイズ種子において窒素応答により転写を調節するタンパク質である可能性が示された。この遺伝子は日本DNAデータバンクに登録し、アクセッションナンバーAB250760を得た。このタンパク質は酵母で知られているクロマチンモデリングファクターの活性ドメインを持つことがタンパク質の配列から予測された。

到目前为止，据透露，β亚基的积累量（一种大豆储存蛋白之一）受可用的谷氨酰胺浓度调节。对使用Miyakogusa acroarray的氮缺陷大豆中高氮供应对基因表达的影响的广泛分析表明，可能涉及无机焦磷酸磷酸酶。在未成熟子叶的体外培养中，正丙酸抑制了磷酸酶活性，并进一步添加了10 mM的无机磷酸盐，β-亚基mRNA积累的恢复程度与磷酸酶的活性不抑制相同的程度。因此，强烈建议通过产生的无机磷酸盐和信号传导的量检测到大豆成熟种子中氮的供应量的增加。使用β亚基基因上游启动子区域的缺失线分析了转录调节区域中的氮反应区域，并鉴定了与调节区域的蛋白质结合。到了往年，已经揭示了氮反应序列在101 bp之间，从转录起源到-732 bp至-631 bp。由于已经在该区域报道了通过DNA结合蛋白SEF1识别的序列，因此创建了由包含SEF1识别序列的串联25BP组成的引物，并使用酵母单杂交系统搜索了DNA结合蛋白。在体外观察到了一种不同的蛋白质表达，并与体外翻译产物和合成寡肽进行了混合。结果，一条带与大豆未成熟子叶的核蛋白混合时的位置大致相同，表明这可能是一种蛋白质，可通过大豆种子中的氮反应调节转录。该基因已在日本DNA数据库中注册，并获得了登录号AB250760。蛋白质序列预测该蛋白具有在酵母中已知的染色质建模因子的活性结构域。

项目成果

Quantitative and isotopic analysis of amino acids, allantoin, and allantoic acid in soybean by LC-MS using the atmospheric pressure chemical ionization method.

使用大气压化学电离法通过 LC-MS 对大豆中的氨基酸、尿囊素和尿囊酸进行定量和同位素分析。

• 发表时间: 2004
• 期刊: Soil Science and Plant Nutrition 50
• 作者: Ohtake N.他4名

大竹憲邦: "窒素によるダイズ種子貯蔵タンパク質集積調節機構の解析"日本土壌肥料学雑誌. 74巻・5号. 597-598 (2003)

Norikuni Otake：“氮对大豆种子储存蛋白积累的调节机制分析”，《日本土壤与肥料杂志》，第 74 卷，第 5 期，597-598（2003 年）。