酸化損傷DNA前駆体2-OH-dATPの哺乳動物細胞における変異誘発機構の解明

阐明哺乳动物细胞中氧化损伤的 DNA 前体 2-OH-dATP 的诱变机制

• 批准号: 04J09270
• 负责人: 佐藤 和哉
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J09270/
• 关键词: mutagenesis; 2-OH-dATP; 8-OH-dGTP; Y-family DNA polymerase; MTH1; MSH2; mutageneswis; dinB; umuDC

1.ヒト由来培養細胞を用いて損傷ヌクレオチドによる変異誘発を解析する系を確立した。ヒト胎児腎由来の293T細胞にSV40 ori配列および変異検出用の標的遺伝子supFを含むプラスミドをトランスフェクションし、SV40 LargeT antigen依存的にプラスミドを複製させた。細胞内における複製反応のピークとなる24hr後に損傷ヌクレオチドを含む低浸透圧溶液中に暴露することで細胞内へ損傷ヌクレオチドを導入し、さらに24hr培養を行った後、複製されたプラスミドDNAを回収した。大腸菌を用いてsupF遺伝子上に変異の生じたプラスミドを選択し、supF変異体率を求めた。dGTP由来の酸化損傷ヌクレオチド8-OH-dGTPを293T細胞へ導入することにより、大きな変異体率の上昇が観察された(2×10^<-4>→8×10^<-4>)。この時誘発された変異をシーケンシングにより解析したところ、そのほとんどがA : T→C : Gトランスバージョンであった。したがって8-OH-dGTPは生細胞においても強い変異原性を有することが示された。一方dATP由来の2-OH-dATPを導入しても、コントロールと比較して有意な変異体率の上昇はみられなかった。2.低浸透圧によるヌクレオチドの導入とsiRNAを用いたノックダウンを組み合わせることで、Y-family DNA polymeraseをはじめとする、種々の遺伝子の損傷ヌクレオチドによる変異誘発への関与について調べた。標的遺伝子として2-OH-dATPおよび8-OH-dGTP分解酵素MTH1、ミスマッチ修復関連酵素MSH2、Y-family DNA polymeraseとしてPol eta、Pol iotaおよびRev1、さらにB-family DNA polymeraseであるPol zetaの触媒サブユニットRev3に対するsiRNAを変異検出用のプラスミドと共導入し、24hr後のノックダウンをウエスタンブロッティング法もしくはRT-PCR法により確認した。同条件において24hr後に8-OH-dGTPを導入し、変異体率を求めたところ、Pol etaおよびRev1をノックダウンした場合において、8-OH-dGTPによる変異誘発が有意に抑制された。したがってこれらのY-family DNA polymeraseは、生細胞における8-OH-dGTPの取り込みもしくは修復に関与していると考えられる。一方、損傷ヌクレオチドによる変異誘発を抑制すると考えられるMTH1、MSH2をノックダウンした場合においても2-OH-dATP導入による変異誘発は観察されなかった。ヒト細胞ではGと対合した2-OH-Aを認識するDNAグリコシラーゼであるMUTYHなど様々な修復酵素の存在が示されており、2-OH-dATPによる変異誘発の抑制に関与する遺伝子についても、さらなる解析が必要である。

1. 我们建立了一个系统，利用人源培养细胞分析受损核苷酸诱导的突变。将含有SV40 ori序列和突变检测靶基因supF的质粒转染人胎肾来源的293T细胞，并以SV40 LargeT抗原依赖性方式复制该质粒。细胞中复制反应达到峰值后24小时，通过将细胞暴露于含有受损核苷酸的低渗透溶液中，将受损核苷酸引入细胞中，再培养24小时后，回收复制的质粒DNA。使用大肠杆菌选择supF基因突变的质粒，并测定supF突变率。通过将dGTP衍生的氧化损伤核苷酸8-OH-dGTP导入293T细胞，观察到突变率大幅增加(2×10^<-4>→8×10^<-4>)。当通过测序分析此时诱导的突变时，大多数是A：T→C：G颠换。因此，8-OH-dGTP 即使在活细胞中也显示出很强的致突变性。另一方面，即使导入源自dATP的2-OH-dATP，与对照相比，也没有观察到突变率的显着增加。 2.通过结合使用低渗透压的核苷酸引入和使用siRNA的敲低，我们研究了包括Y家族DNA聚合酶在内的各种基因在受损核苷酸诱变中的参与情况。以2-OH-dATP和8-OH-dGTP降解酶MTH1为靶基因，以错配修复相关酶MSH2、Pol eta、Pol iota和Rev1为Y家族DNA聚合酶，以B家族DNA聚合酶Pol zeta为催化剂针对Rev3亚基的siRNA与用于突变检测的质粒共同引入，并通过Western印迹或RT-PCR确认24小时后的敲除。在相同条件下，24小时后引入8-OH-dGTP并测定突变率。当Poleta和Rev1被敲低时，8-OH-dGTP的诱变被显着抑制。因此，这些Y家族DNA聚合酶被认为参与活细胞中8-OH-dGTP的摄取或修复。另一方面，即使当被认为抑制由受损核苷酸诱导的突变的MTH1和MSH2被敲低时，通过引入2-OH-dATP也没有观察到突变。在人类细胞中，已证明存在多种修复酶，例如 MUTYH（一种识别与 G 配对的 2-OH-A 的 DNA 糖基化酶），并且还报道了参与抑制 2-OH-dATP 诱变的基因。需要进行分析。