ラフトに集積するシグナル伝達タンパク質群の構造生物学的研究

筏中积累的信号蛋白的结构生物学研究

• 批准号: 04J08909
• 负责人: 小橋川 敬博
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J08909/
• 关键词: NMR; Crk-II; 構造生物学; SH2; SH3; アダプタータンパク質; リン酸化; タンパク質間相互作用; NMR; Crk-II; 構造生物学; SH2; SH3; アダプタータンパク質; リン酸化; タンパク質間相互作用

昨年度に引き続きリン酸化Crk-IIの構造解析及びCrk-IIとCrk-Iの機能解析を行った。非リン酸化Crk-IIの3つのドメインをコンパクトにまとめるのりしろ領域への変異体を作成し、(1)N端側SH3(nSH3)への標的分子の結合能、(2)細胞運動性、(3)増殖活性、(4)細胞形態がCrk-Iに近い挙動を示すようになるとの結果を得ており、構造解析の結果と一致する。これまでに行われていたC端側SH3(cSH3)の機能解析と合わせると、Crk-IIのC末端領域が制御に密接に関わることを示した。今回の構造解析より、C端側領域がCrk-IIのコンパクトな構造の形成へ関与していることが示唆された。また、リン酸化Crk-IIの構造解析の結果より、SH2のみではなくnSH3への標的分子の結合もまた妨げられることが示唆され、結合実験により実際に結合が弱くなることが確認され、リン酸化がCrk-IIのシグナルをストップさせることが示された。本研究成果の一部は8月にドイツのゲッチンゲンで行われた「第22回 生体系の磁気共鳴に関する国際会議」においてポスター発表を行った。昨年度までにキナーゼと基質に互いに結合しあうドメインペアを人為的に導入することでリン酸化を効率的に行えるとの結果を得ていた。また、本年度は本手法を用いることでリン酸化Crk-IIを効率的に脱リン酸化できるとの結果を得た。ラフトに集積することが知られているVavのリン酸化体を調製することにも成功した。本研究成果の一部については12月に特許の追加出願を行った。また、6月に京都で行われた「第5回 産学官連携推進会議」、6月に仙台で行われた「第5回 産学連携フォーラム in仙台」、2月に東京で行われた「タンパク3000総合シンポジウム」においてポスター発表を、11月に京都で行われた「第45回 NMR討論会」において口頭発表を行った。

去年，我们对CRK-II磷酸化的CRK-II进行了结构分析以及CRK-II和CRK-I的功能分析。在硫区域中产生了一个突变体，该突变体紧凑地结合了非磷酸化的CRK-II的三个结构域，发现（1）靶分子与N端SH3（NSH3），（2）细胞运动性，（2）细胞运动的结合能力，（3）的增殖活性，（4）与CRS-I相似的行为，与CRS-I相似。结合先前对C末端SH3（CSH3）的功能分析，证明CRK-II的C末端区域与调节密切相关。该结构分析表明，C端区域与CRK-II紧凑结构的形成有关。此外，磷酸化的CRK-II结构分析的结果表明，靶分子与NSH3的结合，不仅SH2，不仅SH2，而且还受到了NSH3的结合，也受到了障碍，并且结合实验证实了结合实际上削弱了，表明磷酸化阻止了CRK-II的信号。这项研究的一些结果是在八月在德国吉宁根举行的第22届国际磁共振国际会议上的海报中提出的。到去年，我们已经获得了结果，即通过人为地引入与激酶和底物相互结合的域对可以有效地进行磷酸化。此外，我们获得的结果是，使用此方法在一年中，可以有效地脱磷酸化的磷酸化CRK-II。我们还成功制备了VAV的磷酸化产品，该磷酸化产物已知会在筏中积聚。对于这项研究的一些结果，12月提交了一项额外的专利。此外，在6月在京都举行的第五届行业 - 学院政府合作促销会议上，在6月在仙台举行的第五次行业 - 阿卡迪姆政府合作论坛以及2月在东京举行的蛋白质3000蛋白质研讨会上进行了海报演讲，以及在NMR讨论会议上举行的45th Nmr讨论会议上举行的蛋白质3000蛋白质研讨会。