非天然補欠分子を導入した超高機能化ヘムタンパク質の創製

创建结合非天然假体分子的超高功能血红素蛋白

• 批准号: 04J06764
• 负责人: 村田 大
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J06764/
• 关键词: 鉄ポルフィセン; 再構成; 西洋ワサビペルオキシダーゼ; 酸化触媒活性; 反応中間体; 酸化触媒反応; ペルオキシダーゼ; 過酸化水素; ミオグロビン; 酸素錯体

本報告者は活性中心にあるヘムを人工補欠分子に置換する補欠分子再構成法によって、ヘムタンパク質の機能改変・機能向上を目指している。ヘムタンパク質の一種である西洋ワサビペルオキシダーゼ(Horseradish peroxidase, HRP)は非常に高い酸化触媒活性を有する酸化酵素である。このHRPの機能向上を試み、合成によって得られたヘムの構造異性体である鉄ポルフィセンを有する再構成HRPの構築を実施した。実際に酸変性によってヘムを除去したアポHRPに鉄ポルフィセンを挿入し、カラムクロマトグラフィー(サイズ排除・陰イオン交換)による精製を経て鉄ポルフィセンを有する再構成HRPを得た。調製した再構成HRPと過酸化水素との反応を吸収スペクトルにより追跡したところ、2種類の中間体の生成が確認された。そのうち一つは鉄ポルフィセンのπカチオンラジカル種を示す820nm付近の吸収を有することから、oxoferryl πカチオンラジカル種であるcompound Iに相当する中間体であることが判明した。この鉄ポルフィセンのcompound Iの観測は初めての例であり、HRPタンパク質マトリックスを用いることで、穏やかな条件でその形成を確認することに成功した。またstopped-flow法により、過酸化水素存在下での2-methoxyphenolの酸化触媒反応における速度定数を評価した。その結果、compound Iにおける基質の酸化速度定数h、compound IIにおける基質の酸化速度定数k_3はともに天然HRPよりも大きく、再構成HRPにおける反応中間体の活性の高さが明らかとなった。さらにthioanisole酸化反応に対する再構成HRPの触媒活性も天然HRPの約20倍向上することが分かり、HRP内における鉄ポルフィセンの高酸化活性種の高い反応性が実証された。このように、鉄ポルフィセンを有する再構成HRPにおける反応中間体と、酸化触媒活性に対する新しい知見を得た。

作者的目的是使用人工假体分子重建方法来修改和改善血红素蛋白的功能，该方法用人工假体分子取代活性中心的血红素。辣根过氧化物酶（HRP）是血红素蛋白的一种，是一种具有极高氧化催化活性的氧化酶。为了改善该 HRP 的功能，我们构建了一种含有铁卟啉（通过合成获得的血红素的结构异构体）的重构 HRP。实际上，将铁卟啉插入到已通过酸变性除去血红素的apo-HRP中，通过柱色谱法（尺寸排阻/阴离子交换）纯化，获得含有铁卟啉的重构HRP。当通过吸收光谱跟踪制备的重构的 HRP 和过氧化氢之间的反应时，证实了两种类型的中间体的产生。其中之一在820nm附近具有吸收，这表明铁卟啉的π-阳离子自由基种类，并且因此被发现是对应于化合物I的中间体，化合物I是氧代铁基π-阳离子自由基种类。这是首次观察到铁卟啉化合物 I，通过使用 HRP 蛋白基质，我们成功地证实了其在温和条件下的形成。此外，使用停流法评估了过氧化氢存在下2-甲氧基苯酚催化氧化反应的速率常数。结果，化合物I中底物的氧化速率常数h和化合物II中底物的氧化速率常数k_3均大于天然HRP，表明重构HRP中反应中间体的高活性。此外，发现重构的 HRP 对茴香硫醚氧化反应的催化活性比天然 HRP 高约 20 倍，这证明了 HRP 中铁卟啉的高氧化活性物质的高反应活性。通过这种方式，我们获得了关于含铁卟啉的重构HRP中的反应中间体及其氧化催化活性的新知识。

项目成果

Enhancement Peroxidase Activity in Myoglobin by Iron Porphycene as a Prosthetic Group

卟啉铁作为辅基增强肌红蛋白过氧化物酶活性

• 发表时间: 2004
• 期刊: Journal of Porphyrins and Phthalocyanines 8
• 作者: Mieko Morishima;Yasuo Kawaguchi;Kakigi Ryusuke;Dai Murata
• 通讯作者: Dai Murata