ダイナミック・コンビ化学を用いたテーラーメイド型糖質バイオセンサーの開発

使用动态组合化学开发定制碳水化合物生物传感器

• 批准号: 04J06578
• 负责人: 中田 栄司
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J06578/
• 关键词: タンパク質エンジニアリング; Bio-orthogonalな有機化学; レシオメトリー; 蛍光性バイオセンサー; アフィニティーラベル化; 光アフィニティーラベル化; 化学修飾法; orthogonality; 蛍光性糖質バイオセンサー

我々が開発した「光アフィニティーラベル化後修飾法(P-PALM)」は、タンパク質の活性中心近傍に部位特異的に非天然分子を導入できる手法である。初めにその有用性を試した糖結合性タンパク質(レクチン)の一種であるコンカナバリンA(Con A)では、様々な人工分子を導入することで、目的の機能を付与した蛍光性バイオセンサーへと機能変換することに成功している。本年度は、我々がP-PALMで用いたチオール化学とは直交性(orthogonality)を有する高選択的アミノ基修飾法を開発し、これらを組み合わせることでそれぞれ単独では達成できない高機能化を達成できると考え、取り組んだ。具体的には、Con A一分子上に蛍光色素を二重修飾したCon A(AMCA-Fl-Con A)の調整に成功し、その機能評価をおこなった結果、Con Aの糖結合挙動をレシオメトリーで検出可能な蛍光性糖質バイオセンサーへと機能変換できたことを確認した。また、その特性を生かした様々な応用を検討し、糖切断酵素の反応追跡・細胞内・外における糖質のイメージングなどをおこなうことに成功している。この応用例は、従来の一分子の蛍光色素修飾では達成困難であり、本系のようにorthogonalityを有するタンパク質修飾法を併用することで初めて達成できる。本系はその有用性を示した先駆的な研究である(JACS 2005)。その他にも、ランタノイド金属が有する長い発光寿命を利用することで、長寿命かつレシオメトリーで糖認識挙動を検出可能なバイオセンサーの構築(ChemBioChem 2005)にも成功している。さらには、生体内環境下においても用途可能なBio-orthogonalityを有する有機化学としてシッフ塩基の交換反応を利用した「アフィニティーラベル化後修飾法(P-ALM)」を提案し、これをhCAII(JACS ASAP)やSH2 domainなどの蛋白質に対して適応し、人工機能化することにも成功している。特に、SH2 domainに対しては、夾雑蛋白質が多数存在する菌破砕溶液中においても高選択的に機能化することに成功しており、今後、様々な用途での利用が期待される。

我们开发的“照片亲和力后标记的修饰方法（P-PALM）”是一种允许非天然分子在蛋白质的活性中心附近引入非天然分子的技术。首先对其有用性进行了测试的一种糖结合蛋白（凝集素）的姜黄蛋白A已成功将其功能形式转化为荧光生物传感器，该荧光生物传感器通过引入各种人工分子来赋予其所需的功能。今年，我们开发了一种高度选择性的氨基群体修饰方法，该方法与p-palm中使用的硫醇化学是正交的，并且通过将它们结合在一起，我们认为通过将这些化学结合起来，我们可以实现无法自行实现的高功能。具体而言，我们在一个分子上成功调整了具有双重修饰的荧光染料的CON A（AMCA-FL-CON A），并且由于评估了其功能性能，因此可以证实，CON A的糖结合行为能够通过比例检测到可以检测到荧光碳水化合物生物传感器的糖结合行为。此外，已经研究了使用该特性的各种应用，并成功执行了诸如跟踪糖裂解酶和成像碳水化合物的反应。这种应用很难通过单个分子的常规荧光染料修饰来实现，并且只能通过将诸如该系统中的蛋白质修饰方法与正交性相结合来实现。该系统是一项开创性的研究，证明了其有用性（JACS 2005）。此外，通过利用型灯笼金属的长发光寿命，它也成功地构建了一个可以通过长寿命和比例测定的生物传感器，该生物传感器可以检测糖识别行为（Chembiochem 2005）。此外，我们提出了一种“亲和力标记修饰方法（P-ALM）”，该方法利用Schiff碱基的交换反应作为一种有机化学，具有生物直交性，即使在体内环境中也可以使用，并成功地适应了蛋白质，例如HCAII（JACSSAP ASAP ASAP）和SH2 DOMAIN和SH2 DOMAIN，并以此为代理，并使其适应了它的作用。特别是，SH2结构域已成功地在存在许多污染蛋白的细菌破坏溶液中高度选择性地功能化，并预计将来将在各种应用中使用。

项目成果

Luminescent Saccharide Biosensor Using Lanthanide-bound Lectin Labeled with Fluorescein

使用荧光素标记的镧系元素结合凝集素的发光糖生物传感器

• 发表时间: 2005
• 期刊: ChemBioChem 6
• 作者: Nonami A;Taketomi T;Kimura A;Saeki K;Takaki H;et al.;Hiroki Tanaka;Hiroki Tanaka et al.;Hiroki Tanaka;Yuji Sugihara et al.;Hiromichi Tsumori et al.;Hiromichi Tsumori et al.;Yuji Sugihara et al.;津守博通 ら;中田大司ら;E.Nakata et al.;Y.Koshi et al.
• 通讯作者: Y.Koshi et al.