ミトコンドリア・プレ配列レセプターTom20によるプレ配列認識の構造的基盤

线粒体前序列受体 Tom20 前序列识别的结构基础

• 批准号: 04J06414
• 负责人: 帯田 孝之
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J06414/
• 关键词: NMR; X線結晶構造解析; Tom20; プレ配列ペプチド; ミトコンドリア; 核磁気共鳴

ミトコンドリアのマトリックスタンパク質は細胞質で合成された後、ミトコンドリアに輸入される。ミトコンドリアには輸送を司るタンパク質複合体が存在し、なかでもTom20は外膜上に存在してプレ配列に最初に結合する受容体として機能している。このTom20分子による詳細なプレ配列認識機構を解析するために、NMR構造をもとにフレキシブルなN末端とC末端を除いたコア構造に対応するTom20coreを作製し、X線結晶構造解析を行った。Tom20coreとプレ配列(アルコール脱水素酵素由来: ALDH)との結合は弱いため、プレ配列のC末端に人為的に導入したシステインを介してSS結合を形成させたTom20core-プレ配列複合体の結晶化を行った。Tom20coreは大腸菌BL21(DE3)を用いて発現させ、GS4Bカラムにより精製した。ALDHプレ配列はペプチド合成し、逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。Tom20coreとALDHプレ配列をpH8.0にて混合後、一晩室温に静置することによりSS結合を形成させた。その際に、リンカー部の配列を変えることにより、2つの異なる結晶系で結晶を得ることが出来た。一つは、YAGCリンカーで2.1Åの反射データ(空間群:C2、非対称単位中に7分子)を得た。もう一方は、AAGCリンカーで1.9Åの反射データ(空間群:P21、非対称単位中に2分子)を得ることに成功した。YAGCリンカー結晶中、及びAAGCリンカー結晶中でTom20core部分はほぼ同一の構造であった(rmsd<2.5Å)。Tom20に認識される部分のペプチド配列(R14LSRLL19)はαヘリックス構造をとることがわかった。

线粒体的基质邮票与细胞质合成后将进口到线粒体中。线粒体具有控制运输的蛋白质复合物，Tom20是外部膜上存在的受体，并首先结合前阵列。为了通过TOM20分子分析详细的阵列识别机制，核心结构的核心结构不包括柔性N末端和C端，并根据NMR结构创建了C端，并且进行了X射线晶体结构分析。由于TOM20核与排序前的结合（酒精脱氢酶：ALDH）很弱，因此通过半胱氨酸形成SS键的Tom20core-Pre-Pre-Pre-Pre-Pre-Pre-Pre-Pre-Pre-Pre-Precore。使用大肠杆菌BL21（DE3）表达TOM20Core，并通过GS4B色谱柱纯化。 ALDH前的排序序是通过相对相色谱法合成肽并纯化的。将TOM20CORE和ALDH前的排序前与PH8.0混合后，通过在室温下在室温下逐夜形成SS键合。当时，通过更改接头部分的阵列，可以在两个不同的晶体中获得晶体。一个是YAGC接头中的2.1Å（空间组：不对称单元中的7个分子）。另一个通过AAGC接头成功获得了1.9Å反射数据（空间组：p21，2分子）。 TOM20核部分在YAGC接头晶体和AAGC接头晶体（RMSD <2.5Å）中几乎具有相同的结构。发现TOM20中识别的部分的肽序列（R14LSRLL19）具有α螺旋结构。