膜タンパク質活性のQCM上でのin situ解析系の構築

膜蛋白活性QCM原位分析系统的构建

基本信息

批准号：
04J04667
负责人：
三友秀之
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

膜タンパク質はその取り扱いの難しさから、定量的な解析はあまり行われていない。そこで、本研究では膜タンパク質をより定量的に解析するために、水晶発振子マイクロバランス法を用いた解析系の構築を目指した。タンパク質の分泌や膜タンパク質の脂質膜内への埋め込みにおいて重要な働きをもっているSecYEという膜貫通型タンパク質をターゲットとした。より安定で取り扱いが容易な高度好熱菌由来のTSecYEとTSecYEと相互作用しタンパク質の膜透過行うタンパク質であるTSecAの発現・調製を行った。そして、TSecAを部位特異的にbiotin化してAvidinを吸着させた水晶発振子の基板上に固定化し、界面活性剤中において高度好熱菌のTSecYEおよびアミノ酸をタンデムにつないで発現させたdimer状態のTSecYYEとの相互作用解析を行った。その結果、TSecYEはdimer状態をとることでTSecAと強く相互作用するようになり、TSecAとTSecYEとの結合は1:2の割合で起こることが示唆された。より天然に近い状態で解析を行うため、膜タンパク質が脂質膜に埋め込まれた状態において基板上に固定化できるように2つの方法を検討した。1つは、界面活性剤中で精製された膜タンパク質を部位特異的に修飾し、その修飾部位を利用して基板に固定化し、その後界面活性剤を脂質膜に置換する方法である。2つめは、基板に脂質分子を固定化し、固定化した脂質分子をアンカーとして脂質膜と膜タンパク質を基板上で再構成する方法である。前者の方法では膜タンパク質の配向性と固定化密度を制御した生体膜の再構成ができ、後者では膜タンパク質の流動性を確保した生体膜の固定化が行え、それぞれ一長一短をもつ2つの固定化方法が確立できたと考えられ、今後いろいろな膜タンパク質の機能解析に適用されることが期待される。

由于膜蛋白处理困难，定量分析还没有进行太多。因此，在本研究中，我们旨在利用晶体振荡器微天平法构建分析系统，以便更定量地分析膜蛋白。我们的目标是一种称为 SecYE 的跨膜蛋白，它在蛋白质分泌和膜蛋白嵌入脂质膜中发挥着重要作用。我们表达并制备了 TSecYE（更稳定且更易于处理）和 TSecA（一种与 TSecYE 相互作用并允许蛋白质穿过膜的蛋白质）。然后，将TSecA进行位点特异性生物素化并固定在吸附有抗生物素蛋白的石英晶体振荡器基板上，并通过在表面活性剂中串联连接超耐热TSecYE和氨基酸来表达二聚体状态，并进行与TSecYYE的相互作用分析。结果表明，TSecYE 通过采用二聚体状态与 TSecA 强烈相互作用，并且 TSecA 和 TSecYE 之间的结合以 1:2 的比例发生。为了在更接近其自然状态的状态下进行分析，我们研究了两种允许膜蛋白固定在基质上同时嵌入脂质膜中的方法。一种方法是在表面活性剂中对纯化的膜蛋白进行位点特异性修饰，使用修饰的位点将其固定在基质上，然后用脂质膜取代表面活性剂。第二种方法是将脂质分子固定在基底上，并使用固定的脂质分子作为锚在基底上重建脂质膜和膜蛋白。前一种方法允许通过控制膜蛋白的方向和固定化密度来重建生物膜，而后者允许在确保膜蛋白的流动性的同时固定生物膜。预计未来将应用于多种膜蛋白的功能分析。