異種の卵細胞質を利用した初期化誘導法によるラット体細胞クローン個体の作出

使用外源卵细胞质通过重编程诱导法创建大鼠体细胞克隆

基本信息

批准号：
04J03474
负责人：
富岡郁夫
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

<目的)体細胞クローン技術の成功により卵子がリプログラム能力を持つことが示された。近年、アフリカツメガエル(Xenopus)未受精成熟卵子にも哺乳類の体細胞をリプログラムする能力があることが報告された。そこで本研究はXenopus卵子抽出液で体外培養細胞をリプログラムし、生殖工学技術へ応用すること、およびリプログラム化細胞の能力の検討を目的とした。<方法)Xenopus排卵卵子を遠心分離することで水層を抽出した。(1)GFP遺伝子導入マウス胎仔線維芽細胞を透過処理し、Xenopus卵子抽出液に1時間暴露処理し、継続培養した。処理後6日目の細胞から、Oct-3/4をRT-PCRにより検出した。(2)処理細胞がどのような形質を持ったのか調べる目的で、内中外胚葉特異的遺伝子、生殖腺分化関連遺伝子、ES細胞関連遺伝子および卵子卵胞関連遺伝子の発現.についてRT-PCRにより網羅的に解析した。(3)リプログラム化細胞をドナーとし核移植に供試した。電気融合法により核移植胚を作出し、塩化ストロンチウムにより活性化を誘起し発生を観察した。<結果・考察)(1)Xenopus卵子抽出物処理後6日目の細胞でOct-3/4の発現が認められ、リプログラム化された。(2)リプログラム化細胞の遺伝子発現を解析した結果、生殖腺の分化に関連する遺伝子であるGata4,Lhx9,BMP4およびSf-1の発現が認められた。Oct-3/4の発現やアルカリフォスファターゼ活性も検出されたため、リプログラム化細胞は生殖腺の方向へのリプログラムと推察された。(3)リプログラム化細胞を用いて核移植を行った結果、無処理の細胞区より分割率(86% vs 73%)、胚盤胞期胚形成率(61% vs 29%)ともに有意に高くなった。これまでリプログラム化は分子生物学的手法によってのみ証明されてきたが、本研究は初めてリプログラム化を現象として顕した有益なものである。

<目的）体细胞克隆技术的成功表明卵子具有重新编程的能力。最近，有报道称非洲爪蟾未受精的成熟卵具有重新编程哺乳动物体细胞的能力。因此，本研究旨在利用非洲爪蟾卵提取物对体外培养的细胞进行重编程，并将其应用于生殖工程技术，并检验重编程细胞的能力。 <方法）通过对爪蟾卵进行离心来提取水层。 (1)将GFP基因转染的小鼠胎儿成纤维细胞透化，暴露于非洲爪蟾卵母细胞提取物1小时，并连续培养。处理后 6 天，通过 RT-PCR 从细胞中检测到 Oct-3/4。 (2)为了研究处理细胞的特征，我们通过RT-PCR全面研究了内胚层特异性基因、性腺分化相关基因、ES细胞相关基因和卵母细胞-卵泡相关基因的表达情况。。 (3)使用重编程细胞作为核移植供体。采用电融合法制作核移植胚胎，用氯化锶诱导活化，观察发育情况。 <结果/讨论) (1)用非洲爪蟾卵母细胞提取物处理后6天，在细胞中观察到Oct-3/4表达，并对细胞进行重编程。 (2)对重编程细胞中的基因表达进行分析，发现Gata4、Lhx9、BMP4和Sf-1的表达，这些基因是与性腺分化相关的基因。由于还检测到了Oct-3/4表达和碱性磷酸酶活性，因此推断重编程的细胞被重编程为性腺。 (3)使用重编程细胞进行核移植的结果是，分裂率（86% vs 73%）和囊胚期胚胎形成率（61% vs 29%）都显着高于未处理的细胞。到目前为止，重编程仅通过分子生物学方法得到证实，但这项研究很有用，因为它首次揭示了重编程作为一种现象。

项目成果

期刊论文数量（4）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

近年のラット発生工学の進歩

大鼠发育工程的最新进展

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
東北畜産学会報 56(3)
影响因子：
0
作者：
富岡郁夫;松本阿佐子;清水隆;佐藤英明
通讯作者：
佐藤英明

Pronuclear formation and mitotic assembly during the first division in rat reconstructed embryos produced by somatic nuclear transfer.

体细胞核移植产生的大鼠重建胚胎第一次分裂期间的原核形成和有丝分裂组装。

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
Journal of Reproduction and Development 56(in press)
影响因子：
0
作者：
Ikuo Tomioka;Eiji Mizutani;Tomoyuki Yoshida;Atsushi Sugawara;Kentaro Inai;Hiroshi Sasada;Eimei Sato.
通讯作者：
Eimei Sato.