インスリン非依存型糖尿病の疾患モデルブタ開発

非胰岛素依赖型糖尿病疾病模型猪的开发

基本信息

批准号：
04J03475
负责人：
山中賢一
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J03475/
关键词：
体細胞核移植リプログラミングトリコスタチンA DNAヒストンアセチル化 GFP 遺伝子改変動体細胞クローンブタ糖尿病共移植性周期の同期化単為発生遺伝子改変動物ドナー細胞レシピエント卵子エピジェネティクス活性化

项目摘要

前年度までにクローンミニブタの作出に成功したが、その作出効率はと0.1%と非常に低率であった。そこで本年度は、クローン胚の遺伝子発現を受精卵に近づけることを目的とし、遺伝子発現の制御を担っているもののひとつであるDNAヒストンの化学修飾に注目した。具体的には、ヒストンのアセチル化レベルに焦点をあて、脱アセチル化酵素阻害剤(TSA)を用いて人為的にクローン胚のクロマチン構造の修飾を誘起することによりクローン胚の発生能を向上させることを目的とした。5nM TSAで活性化後クローン胚を処理することにより、クローン胚の胚盤胞形成率は、処理15時間(33.3%)区および20時間区(31.3%)で0時間区(17.5%)と比較して有意に高かった。クローン胚の核の動態は、活性化開始後10時間で前核形成率がプラトーに達し、その後20時間で分割卵へ移行しているものが多く観察された。前核形成率がプラトーに達した時期にTSA処理を施した区でクローン胚の発生率が向上されたことから、前核期にTSA処理を施すことが有効であると示唆された。また、ヒストンH3のアセチル化レベルを解析した結果、無処理のクローン胚では受精卵と比較し低いレベルであったのに対し、TSA処理クローン胚では受精卵と同等のレベルであった。以上の結果から体細胞クローン胚では前核期におけるヒストンのアセチル化レベルが受精卵と比較して低く、アセチル化レベルを人為的に高めることで高い発生能を持ったクローン胚を作製できることが示された。また、遺伝子導入細胞をドナー細胞として用いる場合、そのセレクション過程での継代数の増加が作出効率に影響を及ぼす可能性がある。そこで、実際に遺伝子改変細胞をドナー細胞として用いて作製したクローン胚を遺伝子改変ミニブタの作出を試みた。本研究はインスリン非依存型糖尿病の疾患モデルブタを開発することを目的としているが、目的とした遺伝子改変細胞が得られていないため、今回はレポーター遺伝子としてGFP遺伝子を導入した細胞をドナー核として用いた。その結果、移植した仮親は高率(75%,6/8)に妊娠した。ブタはヒトと解剖・生理学的に近いという性質から実験動物として注目されている。よって、現在妊娠中ではあるがGFP導入ミニブタが得られた場合、これらのミニブタは臓器移植後にモニタリングができるため、臓器移植医療における研究への貢献が期待される。

克隆的迷你猪的产量在上一年取得了成功，但生产效率非常低，为0.1％。因此，今年，我们专注于DNA组蛋白的化学修饰，DNA组蛋白是控制克隆胚胎中基因表达的事物之一，目的是将基因表达带入更接近受精卵的基因表达。具体而言，目的是通过使用脱乙酰基酶抑制剂（TSA）人为地诱导克隆胚胎的染色质结构来提高克隆胚胎的发育能力。通过5nm TSA激活后，通过治疗克隆的胚胎，在治疗中，克隆的胚胎的胚泡形成速率显着更高15小时（33.3％）和20小时（31.3％），而0小时（17.5％）。观察到克隆的胚胎中的核动力学，在激活发作后10小时，前核形成速率达到了一个高原，然后在20小时后转变为分裂的卵。当核核速率达到高原时，在用TSA处理的地区中，克隆胚胎的发生率得到了改善，这表明在前核阶段进行TSA处理是有效的。此外，分析了组蛋白H3的乙酰化水平，与受精卵相比，未经处理的克隆胚胎中的水平较低，而水平与TSA处理的克隆的胚胎中受精卵的水平相当。以上结果表明，与受精卵相比，在体细胞克隆胚胎中，核型中组蛋白的乙酰化水平较低，并且通过人为地提高乙酰化水平，可以产生具有高发育能力的克隆胚胎。此外，当将转基因细胞用作供体细胞时，选择过程中通道数量的增加可能会影响生产效率。因此，我们尝试使用克隆的胚胎实际上使用遗传修饰的细胞作为供体细胞产生的克隆胚胎产生了转基因的迷你铅。这项研究旨在为非胰岛素依赖性糖尿病开发疾病模型，但是由于尚未获得靶标遗传修饰的细胞，因此将其作为供体基因作为供体核作为供体基因而转移的细胞。结果，移植的临时父母以高率怀孕（75％，6/8）。猪由于与人类以及解剖学和生理学上的亲密关系而引起人们的注意。因此，如果目前怀孕但获得了诱导GFP诱导的迷你猪，则可以在器官移植后监测这些迷你猪，因此预计它们将有助于器官移植医学的研究。