温感性ハイドロゲルを用いたオンチップ生物分子ソーターの開発と応用研究

热敏水凝胶片上生物分子分选仪的开发与应用研究

基本信息

批准号：
04J01756
负责人：
白崎善隆
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J01756/
关键词：
温度感受性ハイドロゲルオンチップマイクロソーター量子ドットミトコンドリア PDMS シースフロー局所加熱温感性ハイドロゲル分子ソーターマイクロ流路 1分子検出メビオールゲル高感度検出ゲルバルブ蛍光検出単離・精製

项目摘要

マイクロチップの生産向上を念頭に分離システムの再構築を行った。チップ素材には塑造できるPoly dimethyl siloxane(PDMS)を採用した。また、キャリア溶液によって試料溶液を挟み込んでシースフローとし、試料溶液を廃棄側分岐のみに流し込めるようにした。これにより、蛍光粒子が検出されない間は、赤外レーザーで局所加熱すること無しに試料溶液を廃棄できるようになった。一方、蛍光粒子が検出された場合は、瞬間的な加熱を廃棄側分岐に与え、試料溶液の流れを一時的に回収側分岐に向かせることで、蛍光粒子の分離を実現した。直径1μm以下の蛍光ビーズを試料として分離を行ったところ、検出分離の1サイクルにかかる時間を約5msまで高速化することに成功した。さらに上記で構築した分離システムをもとに、システムの安定性、操作の容易さを目指し、送液チューブとチップとの接続部の高耐圧化、分離部以外の流路を太くすることによる従来よりも一桁低い背圧での送液を実現した。また、キャリア溶液と試料溶液の流量比を流路形状によって調整し、従来3つの独立したポンプを必要としていた送液を1つのポンプのみで制御可能とした。高感度化では、シースフローによる試料溶液の3方向からの囲い込みを実現し、試料溶液の流れる範囲を幅2.2Fm、高さ1.4μmにまで絞り込み、高開口数の対物レンズを用いた高感度検出を実現した。実際、試料溶液を流れる量子ドットの蛍光シグナルを明瞭に検出し、分離することができた。HeLa細胞のミトコンドリアをMito Tracker Green FM(Invitrogen)によって選択的に蛍光染色し、セルライセートから本システムによって検出・分離を行った。結果、ミトコンドリアの蛍光シグナルを明瞭に検出することが出来、検出したミトコンドリアのうち、92%程度を分離することに成功した。

重建分离系统的目的是要牢记微芯片的生产。芯片材料由支持塑料的聚二甲基硅氧烷（PDM）制成。此外，将样品溶液夹在载体溶液之间以形成护套，从而使样品溶液仅通过废物侧的分支倒入。这允许在不使用红外激光的情况下丢弃样品溶液，而未检测到荧光颗粒。另一方面，当检测到荧光颗粒时，将瞬时加热应用于废物侧分支，并将样品溶液的流动临时针对恢复侧分支，从而实现了荧光颗粒的分离。当将直径为1μm的荧光珠分开为样品时，一个检测和分离周期所需的时间已成功增加到约5 ms。此外，基于上面构建的分离系统，我们在液体进料管和芯片之间的连接部分达到了高压电阻，并增加了除分离部分以外的其他流动路径，从而导致反向压力低于以前的一个数量级。此外，根据流动路径形状对载体溶液和样品溶液的流速比进行调整，允许仅由一个泵控制以前需要三个独立泵的液体进料。在高灵敏度中，可以通过鞘流从三个方向封闭样品溶液，从而将流动的样品溶液缩小到2.2fm的宽度和1.4μm的高度，并使用高数值孔径物镜实现高灵敏度检测。实际上，清楚地检测并分离了流过样品溶液的量子点的荧光信号。用Mito Tracker绿色FM（Invitrogen）选择性地将线粒体荧光染色，并使用该系统检测并与细胞裂解物分离。结果，明确检测到线粒体荧光信号，并成功分离了约92％的线粒体。