モーター分子KIF1Aの分子遺伝学的研究

运动分子KIF1A的分子遗传学研究

基本信息

批准号：
04F04658
负责人：
廣川信隆
金额：
$ 0.77万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04F04658/
关键词：
モーター分子キネシン KIF1A ジーンターゲテイングハイポモルフ

项目摘要

細胞内の多種類のオルガネラはこれらのモーター分子によって各々決められた場所へ輸送されていると考えられる。この機構を解明することは細胞生物学における非常に重要な課題である。私はそのための有力な方法のひとつとして、ジーンターゲテイング法を用いて変異マウスを作製し、得られたマウスを細胞生物的手法によって解析している。神経系に特異に発現するユニークなモノマー型順方向性モーター分子KIF1A遺伝子欠損マウスは、生後24時間以内に全て死亡したことが、これまでの我々の研究室の従来型のノックアウトの結果より明らかになっている。これらの遺伝子の機能をさらに発生・分化が進んだ段階の組織・細胞において解析するために、KIF1Aハイポモルフマウスを作成し、その解析することを通じて、KIF1Aの生体内での機能についての知見を得ようと試している。KIF1AのPH domainはトランスファーベクターに挿入し、組み替え得たウイルスを増幅して培養細胞に感染させ、KIF1Aの抗原を大量に産生させました。さらに抗体の精製を完成し、精製した抗体を用い、免疫沈降実験を行った。沈降した物質中に、Trkという神経栄養因子神経細胞での物質輸送のカーゴ分子の一つと考えられる。培養細胞では、TrkとKIF1Aのcolocalizationも発現した。TrkがDRGの細胞内に存在している、KIF1Aハイポモルフマウスは、功能障害のため、DRGの細胞が死になった。さらに、死にそうな細胞の中で、Trk抗体で染まるものがたまっていることも発現した。電子顕微鏡でたまっているものをはっきり観察した。Trk signalの下流であるリン酸化Erkとリン酸化Aktはsignalが弱くなった。今はモーター分子とカーゴ分子に蛍光蛋白を融合させ神経細胞にウィルスを用いて遺伝子導入し、モーター分子とcargoの動態を解析している。

据信，这些运动分子将细胞内的许多类型的细胞器转运到每个指定位置。了解这种机制是细胞生物学中非常重要的问题。为此，最有前途的方法之一是使用基因靶向方法生成突变小鼠，并使用细胞生物学方法分析所获得的小鼠。我们实验室的先前常规敲除结果表明，缺乏KIF1A基因的小鼠是一种独特的单体前向运动分子，专门在神经系统中表达，所有小鼠都在生命后24小时内死亡。为了进一步分析这些基因在发育和分化进展的阶段中这些基因在组织和细胞中的功能，创建了KIF1A hypomorph小鼠，并试图通过分析来深入了解KIF1A在体内的功能。将KIF1A的pH结构域插入转移载体中，并将重组病毒扩增以感染培养的细胞，从而产生大量的KIF1A抗原。此外，纯化抗体，并使用纯化的抗体进行免疫沉淀实验。它被认为是在沉积物质中称为TRK的神经营养因子神经元中运输物质的货物分子之一。培养的细胞还表示TRK和KIF1A的共定位。 DRG细胞中存在TRK的KIF1A hypomorph小鼠由于功能障碍而死亡。此外，还揭示了在可能死亡的细胞中，积累了TRK抗体的细胞。在电子显微镜下清楚地观察到累积的物体。 TRK信号下游的磷酸化ERK和磷酸化的Akt削弱了信号。现在，我们将荧光蛋白融合到运动分子和货物分子中，使用病毒将基因转染至神经元，并分析运动分子和货物的动力学。