新規リボソーム非依存型ペプチド合成酵素の構造・機能相関に関する研究

新型核糖体非依赖性肽合成酶的构效关系研究

• 批准号: 04F04468
• 负责人: 森川 正章
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04F04468/
• 关键词: 非リボソーム型ペプチド合成酵素; チオエステラーゼドメイン; arthrofactin; Pseudomonas属細菌; 部位特異的突然変異; 環状化反応; バイオサーファクタント; リポペプチド; NRPS; Pseudomonas; リボソーム非依存型; エピメラーゼ; 遺伝子破壊

非リボソーム型ペプチド合成酵素は生理活性のある非常に多様な複合/環状ペプチド類を合成することができる。合成最終段階の環状化反応と産物の遊離は合成酵素のC末端に存在するチオエステラーゼドメイン(TE)の働きにより進行する。Pseudomonas属細菌MIS38が有するarthrofactin合成酵素は3つのサブユニット(ArfA/B/C)から構成される。興味深いことにArfCのC末端には2つのTEが存在する。いずれのTE(TE1,TE2)も活性発現に必須のSr/Asp/Hisを有している。本研究では、これらのTEが合成反応にどのように係わっているのかを解明することを目的とした。当該遺伝子部分を大腸菌用ベクターを用いてクローニングした後、PCR法を用いて部位特異的突然変異遺伝子を構築した。さらにこの変異遺伝子を相同性組み換え法によりMIS38染色体に戻した。こうして、S91A,S91T,S383A,S383/D410A変異株を作製した。塩基配列解析を行い、それぞれの位置以外に突然変異が導入されていないことを確認した。こうして得られた変異株のarthrofactin生産性を調べた。その結果、S91A,S91T変異株は生産性を完全に失っていた。一方、S383AおよびS383A/D410A変異株は野生株に比べて5±1%の活性を保持していた。またこれら変異株が生産するarthrofactinは野生株のものと同一の構造であることを確認した。以上の結果から、S91を含むTE1が環状化反応と産物の遊離に必須であり、TE2は本質的に重要ではないことが判明した。現在,この仮説を証明するためにTE2を完全に決失した変異株を作成中である。

非核糖体肽合成酶能够合成多种生物活性复合物/环肽。合成的最后阶段，即环化反应和产物的释放，通过合酶 C 末端的硫酯酶结构域 (TE) 的作用进行。假单胞菌属细菌 MIS38 所拥有的节活素合酶由三个亚基 (ArfA/B/C) 组成。有趣的是，ArfC 的 C 端有两个 TE。两种 TE（TE1、TE2）都具有表达活性所必需的 Sr/Asp/His。本研究的目的是阐明这些 TE 如何参与合成反应。使用大肠杆菌载体克隆该基因部分后，使用PCR方法构建位点特异性突变基因。此外，该突变基因通过同源重组返回至MIS38染色体。这样，产生了S91A、S91T、S383A和S383/D410A突变株。进行碱基序列分析并确认在任何其他位置均未引入突变。检查由此获得的突变株的节活素生产力。结果，S91A和S91T突变株完全丧失了生产力。另一方面，与野生型相比，S383A和S383A/D410A突变株保留了5±1%的活性。我们还证实这些突变株产生的节活素具有与野生型相同的结构。上述结果表明，含有S91的TE1对于环化反应和产物的释放至关重要，而TE2基本上不重要。我们目前正在创建一种突变菌株，其中 TE2 已被完全删除，以证明这一假设。

项目成果

Phylogenetic analysis of condensation of domains in the nonribosomal peptide synthetases.

非核糖体肽合成酶中结构域浓缩的系统发育分析。

• 发表时间: 2006
• 期刊: FEMS Microbiology Letters 252
• 作者: Niran Roongsawang;Siew Ping Lim;Kenji Washio;Kazufumi Takano;Shigenori Kanaya;Masaaki Morikawa
• 通讯作者: Masaaki Morikawa