プロテオミクスの手法によるシロイヌナズナ花粉管伸長機構の解明

利用蛋白质组学技术阐明拟南芥花粉管伸长机制

基本信息

批准号：
04F04172
负责人：
木下修一
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

植物の授精は、雌しべの柱頭に着いた花粉が発芽し、花粉管が伸長して胚珠に到達して起こる。花粉-雌しべ間の相互作用により引き起こされる外的/内的シグナルを介して、数多くの蛋白質が、花粉管の発芽・伸長を促進したり抑制したりしてこの過程を制御している。これらのシグナルやその伝達系路についてはまだ不明な部分が多い。そこで、我々は、シロイヌナズナ花粉の蛋白質をプロテオミクスの手法を用いて解析することで、花粉管伸長や、授精に関わる重要な蛋白質を同定することを目的として研究を行った。シロイヌナズナ約3000花分の花粉より蛋白質を抽出し、二次元電気泳動で展開、PVDF膜に転写後CBBで染色し、35のメインスポットを得た。これらをトリプシン消化後、質量分析計(LC MS/MS)で解析したところ、21のスポットについて、シロイヌナズナ蛋白質と同定できた。また、シロイヌナズナにおいて、タバコのプロテインキナーゼPK1、PK2と高い相同性を持つ遺伝子のクローニングも行った。このタバコのキナーゼは、花粉/花粉管で特異的に発現しており、花粉の発生や花粉管伸長に重要な役割をしていると考えられている。RT-PCRの結果、シロイヌナズナでも、このキナーゼは、葉や根にはなく、花でのみ発現していた。次に、このキナーゼと、花粉/管内での役割がよく研究されているRop1遺伝子をGST融合タンパク質として大腸菌で発現させた。発現蛋白質は精製が困難であったため、C末端にStrep tag2を付加させた別の発現ベクターも構築し、現在発現蛋白質の精製を行っている。以下、アフィニティキャプチャー法により、精製したGST融合蛋白質と相互作用する花粉蛋白質をSDS-PAGEで分析し、特異的なスポットについてはゲル内消化後、MS/MS解析で同定、遺伝子のクローニング、構造解析を行う予定である。同様の方法で、タバコのPK1、PK2のGST融合タンパク質について、タバコ花粉抽出液中に、相互作用する蛋白質を検索した。特異的なスポットがいくつか観察され、MSで解析を行ったところ、elongation factor、メチオニン合成酵素、ヒートショック蛋白質が同定された。確認のため、再度実験を行っている。タバコ、シロイヌナズナ双方の結果を比較することで、このシグナル伝達系についてより信頼性の高い情報が得られると期待される。

当达到雌蕊污名的花粉发芽时，会发生植物授精，从而导致花粉管延伸并到达胚珠。许多蛋白质通过通过花粉 - 杆子相互作用引起的外部/内部信号来促进或抑制花粉管的发芽和伸长来控制这一过程。这些信号及其传输路径仍然有很多未知数。因此，我们进行了研究，目的是通过使用蛋白质组学技术来分析拟南芥花粉蛋白来鉴定参与花粉管扩展和授精的重要蛋白质。从大约3,000个拟南芥花的花粉中提取蛋白质，这些花由二维电泳开发，转移到PVDF膜上，并用CBB染色，从而产生35个主要斑点。胰蛋白酶消化后，使用质谱仪（LC MS/MS）对其进行分析，并将21个斑点鉴定为拟南芥蛋白。在拟南芥中，还克隆了与烟草蛋白激酶PK1和PK2具有高同源性的基因。这种烟草激酶在花粉/花粉管中特别表达，被认为在花粉产生和花粉管扩展中起重要作用。 RT-PCR表明，在拟南芥中，这种激酶不是在叶子或根中表达的，而是在花中表达。该激酶和ROP1基因在花粉/管中的作用进行了很好的研究，然后在大肠杆菌中以GST融合蛋白表示。由于表达的蛋白很难纯化，因此还用添加到C末端的链球菌Tag2构建了另一个表达载体，并且目前正在纯化表达的蛋白质。通过亲和力捕获方法对以下分析进行分析，以分析通过SDS-PAGE与纯化的GST融合蛋白相互作用的花粉蛋白，并将特定的斑点在凝胶中消化，然后通过MS/MS分析进行鉴定，基因克隆和结构分析。以类似的方式，在烟草花粉提取物中搜索了相互作用的蛋白质，以了解烟草PK1和PK2的GST融合蛋白。观察到了几个特定的斑点，并通过MS分析揭示了伸长因子，蛋氨酸合酶和热休克蛋白。我们正在进行另一个实验以确认。比较烟草和拟南芥的结果，有望提供有关此信号系统的更可靠的信息。