変異型サイトケラチン遺伝子導入による中間径フィラメントと細胞質内凝集体の機能解析

通过引入突变细胞角蛋白基因对中间丝和细胞质聚集体进行功能分析

• 批准号: 15790371
• 负责人: 花田 慎一郎
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Kurume University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15790371/
• 关键词: アグリソーム; サイトケラチン; マロリー体; 国際情報交換; 中間径フィラメント; 凝集体; タイト結合; 接着結合; 遺伝子導入; GFP; ゴルジ装置

【目的】中間径フィラメント(IF)を含む細胞骨格はjunctional complexと密接な関係を持つが、タイト結合(TJ)、接着結合(AJ)とIFとの関連は不明である。一方、各種肝疾患ではIFの網目構造消失と凝集体形成がみられ、この形態学的特徴はマロリー体として知られているが、その細胞生物学的意義は不明である。今回我々は培養細胞を用い、変異型サイトケラチン(CK)遺伝子導入による凝集体形成時のTJ、AJ関連蛋白を含む細胞内蛋白の局在、細胞形態について検討した。【方法】Green fluorescent proteinで標識した野生型、変異型CK18遺伝子(arg89cys ; CK18 R89C)を作製し、培養ヒト肝癌由来細胞(Huh7)、ヒト不死化肝細胞(OUMS-29)、MDCK細胞、HEK293細胞に遺伝子導入を行った。48時間後、「間接蛍光抗体法にて各種蛋白を染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。また、変異型CK18遺伝子導入細胞を電子顕微鏡にて観察した。【成績】変異型CK18遺伝子導入によりIFの網目構造が消失し、凝集体が形成された。これらの細胞では細胞面積の増加と形態変化がみられた。電子顕微鏡による観察では、凝集体は形質膜を持たず、細胞内小器官を含有し、周囲には線維性構造物がみられた。免疫染色では、膜裏打ち蛋白(ZO-1、β-catenin、desmoplakin)、glucose-6-phosphate dehydrogenase、14-3-3ζ蛋白は凝集体と共在していた。この局在変化は膜蛋白(occludin、 E-cadherin)ではみられなかった。【結論】IFの関与する凝集体形成は細胞内蛋白の局在に影響を与え、その結果細胞の機能に影響を与えることが推測される。またIFが細胞の形態維持に重要であると考えられた。

目的：含有中间丝（如果）的细胞骨架与连接络合物有密切的关系，但是紧密键（TJ），粘合键（AJ）之间的关系以及是否未知。另一方面，各种肝脏疾病表现出网络结构的丧失和IF骨料的形成，尽管这种形态学特征被称为玛丽人体，但其细胞生物学意义却未知。在这项研究中，我们研究了通过转染的突变细胞角蛋白（CK）基因形成聚集体期间，包括TJ和AJ相关蛋白在内的细胞内蛋白质的定位和细胞形态。 [方法]制备了用绿色荧光蛋白标记的野生型，突变体CK18基因（Arg89Cys; CK18 R89C），并将基因转染到培养的人肝癌衍生细胞（HUH7），人类不朽的肝细胞（OUMS-29），MDCK细胞，MDCK细胞和Hek293。 48小时后，使用间接荧光抗体法染色了各种蛋白质，并使用共聚焦激光显微镜观察。另外，在电子显微镜下观察到突变的CK18转染细胞。 [结果] IF的网络结构由于突变的CK18基因转移而消失，并形成了聚集体。这些细胞显示细胞区域和形态变化的增加。电子显微镜观察表明，骨料没有质膜，包含细胞内细胞器，并且在它们周围发现了纤维结构。在免疫染色，膜内膜蛋白（ZO-1，β-catenin，desmoplakin），葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和14-3-3ζ蛋白与聚集体共存。这种定位变化是膜蛋白（闭塞素，[结论]据推测，IF参与的聚集体的形成影响细胞内蛋白的定位，因此，它影响了细胞的功能。此外，如果被认为是维持细胞形态的重要性。