C型肝炎ウイルス(HCV)複製モデルを用いたHCV増殖に伴う肝発癌機序の解明

使用丙型肝炎病毒 (HCV) 复制模型阐明与 HCV 增殖相关的肝癌机制

基本信息

批准号：
15790350
负责人：
日浅陽一
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Ehime University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

T7 promoterの下流にC型肝炎ウイルス(HCV)全長のcDNAを持つプラスミド(pH77)をCV-1細胞あるいはHuh7細胞にトランスフェクションし、さらにT7ポリメラーゼを発現する組換えアデノウイルス(Ad-T7)を感染させることによりHCV遺伝子を宿主細胞に発現させHCV replication systemを開発した。感染後HCV negative鎖およびHCVコア蛋白は、real-time RT-PCRあるいはWestern Blottingにて9日まで持続的に検出可能でありHCV replicationが確認された。さらに、T7 polymeraseを持続発現する細胞株(Huh-T7)を用いてアデノウイルスを用いないHCV replication systemを樹立し得た。この系においてもHCV negative鎖とHCVコア蛋白の発現持続をみた。これらの系を用いてHCV増殖とそれに関連するPKR, Interleukin-8(IL-8)について発癌への寄与の有無を検討した。PKRは癌抑制蛋白として報告されているが、これらの系ではHCV発現によりPKRの発現は全ての細胞株で増加した。またPKR活性化の指標であるphosphorylated PKRの増加、phosphorylated eIF2α/total eIF2α比の増加がみられた。HCV E2蛋白・NS5A蛋白を介したPKR抑制作用はこの系においては明らかではなかった。C型肝硬変患者の癌部・非癌部を用いた検討でも、肝細胞癌部では非癌部に比べてPKR発現量の増加、phosphorylated eIF2α/total eIF2α比の増加を伴うPKR活性化がみられた。このことより、PKRはC型肝炎において癌抑制蛋白としてよりもむしろ癌促進因子として働いている可能性が示唆された。PKRと同様にHCV replicationに関わることが報告されているInterleukin-8(IL-8)についてはHCV発現によりmRNAおよび上清中への産生増加がみられた。今後増加したIL-8がHCV増殖、発癌を促進するかについてはさらに検討する必要があると思われる。

Downstream of the T7 promoter, a plasmid (pH77) carrying a full-length cDNA of hepatitis C virus (HCV) was transfected into CV-1 or Huh7 cells, and then infected with a recombinant adenovirus (Ad-T7) that expresses T7 polymerase, thereby expressing the HCV gene in the host cell, and an HCV replication system was developed.感染后HCV阴性链和HCV核心蛋白可以通过实时RT-PCR或Western blotting连续检测到直到9天，并确认了HCV复制。此外，使用连续表达T7聚合酶的细胞系（HUH-T7）建立了无腺病毒的HCV复制系统。在该系统中，我们还观察到HCV负链和HCV核心蛋白的表达的持久性。使用这些系统，我们研究了HCV增殖及其相关的PKR是否有助于致癌。尽管PKR据报道是癌症抑制蛋白，但在这些系统中，由于HCV表达，所有细胞系中PKR的表达都会增加。此外，观察到观察到磷酸化的PKR的增加，这是PKR激活的指标，并且观察到磷酸化的EIF2α/总EIF2α比的增加。在该系统中，PKR通过HCV E2蛋白和NS5A蛋白的抑制作用尚不清楚。在使用C型肝硬化患者的癌症和非癌性区域的研究中，在肝细胞癌中观察到PKR激活，与非癌性区相比，PKR表达水平的升高，PKR表达水平升高和磷酸化的EIF2α/总EIF2α比的增加。这表明PKR可能是促癌因子，而不是肝炎中的癌症抑制蛋白C.白介素-8（IL-8），据报道，该因素与PKR这样的HCV复制涉及，由于HCV表达而增加了产生，并增加了产量为mRNA和超中途。似乎需要进一步的考虑来确定IL-8增加是否促进了未来的HCV生长和致癌作用。