tRNAのアンチコドンゆらぎ塩基への硫黄・セレン挿入機構

硫和硒插入 tRNA 反密码子摆动碱基的机制

基本信息

批准号：
15780070
负责人：
三原久明
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

tRNAの修飾塩基である5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン(mnm^5s^2U)は、tRNAのアンチコドンのゆらぎ塩基に特異的に存在し、アミノアシル化およびリボソーム上での翻訳の効率化にとって重要な役割を担っている。本研究ではmnm^5s^2Uとその誘導体である5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン(mnm^5se^2U)の生合成に関与するシステインデスルフラーゼとセレノリン酸シンテターゼ、tRNA硫黄転移酵素(MnmA)の機能解析を目的とした。(1)2-チオ化活性未修飾tRNA^<Lys>を、IscS、野生型および変異型MnmA、[^<35>S]-L-システイン、MgATP、ジチオスレイトール(DTT)とともにインキュベーションし、ホスフォイメージャーを用いて^<35>Sで標識されたtRNAを検出した。その結果、D17A、C102A、C199Aを用いた反応では^<35>S標識tRNAは生成されず、Asp17、Cys102、Cys199がMnmAの酵素活性にとって重要な残基であることが明らかとなった。(2)IscSからMnmAへの硫黄転移反応^<35>S標識ペルスルフィド型IscSを野生型および変異型MnmAとインキュベーションし、PAGEで分離後、ホスフォイメージャーを用いて^<35>S標識MnmAを検出した。その結果、野生型酵素およびC199Aと比較して、C102Aに転移した硫黄の量は著しく少ないことが明らかとなった。この結果より、Cys102がペルスルフィド型IscSから硫黄を受け取る残基であると考えられた。(3)AMP生成反応本酵素反応により生成するATP分解産物を、HPLCを用いて分析した。野生型MnmAをMgATPのみとインキュベーションした場合と比べて、この反応液にtRNA、IscS、L-システインを添加した場合にAMPの生成量が著しく増加した。このことは、本酵素反応において、tRNAがアデニル化される可能性を示唆している。以上の結果より、以下のような反応機構が考えられた。ペルスルフィド型IscSの硫黄はMnmAのCys102に転移する。一方で、MnmAはATPを用いてtRNAの34番目のウリジンの2位の酸素をアデニル化により活性化する。Cys102上のペルスルフィドの硫黄、または遊離した硫黄がピリミジン環の2位炭素を求核攻撃してAMPが遊離し、最終的にs^2Uが生成する。

5-甲基氨基氨基甲基-2-硫代氨酸（MNM^5S^2U），一种修饰的tRNA碱，特异性存在于tRNA反登起波动基碱中，并且在核糖体上翻译的氨基酰胺和效率中起着重要作用。这项研究旨在分析半胱氨酸脱硫酶，硒磷酸合成酶和tRNA硫转移酶（MNMA）的功能分析，这些酶（MNMA）参与了MNM^5S^2U的生物合成及其衍生物的生物合成，5-甲基氨基氨基氨基氨基氨基氨基氨基氨基氨基氨基氨基氨基介胺（MnioriDine）（Mnyminyminyminymethylidine）（Mnminyminyminyminymethylidine（Mnioriridine）（Mnminyminyminyminymethiridine）（mnm^5se^5se^5se^2u）。（1）将2-硫醇的活性未修饰的tRNA^<lys>与ISC，野生型和突变型MNMA孵育，[^<35> s] -l- cysteine，mgatp，mgatp，dithiothreitol（dtt），并使用phosphoimagerageragerageragerageragerageragerageragerageragerageragerage。结果，使用D17A，C102A和C199A和ASP17，CYS102和CYS199在反应中无标记的tRNA是MNMA酶活性的重要残基。（2）从ISC到MNMA ^<35> S标记的硫化物类型ISC的硫转移反应与野生型和突变的MNMA孵育，按PAGE分离，然后使用磷酸iMimager检测到 ^<35> S标记的MNMA。结果表明，与野生型酶和C199A相比，转移到C102A的硫量显着降低。从此结果，可以认为Cys102是从硫化物类型ISC接收硫的残基。（3）使用HPLC分析了该酶反应产生的ATP降解产物。与单独使用MGATP孵育野生型MNMA的情况相比，当将TRNA，ISC和L-半胱氨酸添加到该反应中时，产生的AMP量显着增加。这表明酶反应中可能会腺苷酸化的可能性。基于上述结果，考虑了以下反应机制。 MNMA中的硫化物类型ISC的硫转移至Cys102。另一方面，MNMA使用ATP通过腺苷酸化的第34位位置在尿苷位置激活氧气。 cys102或游离硫的硫化物硫的硫酸硫硫酸含量会攻击嘧啶环的2位碳，释放AMP，最终产生S^2U。