tRNAのアンチコドンゆらぎ塩基への硫黄・セレン挿入機構

硫和硒插入 tRNA 反密码子摆动碱基的机制

基本信息

批准号：
15780070
负责人：
三原久明
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

tRNAの修飾塩基である5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン(mnm^5s^2U)は、tRNAのアンチコドンのゆらぎ塩基に特異的に存在し、アミノアシル化およびリボソーム上での翻訳の効率化にとって重要な役割を担っている。本研究ではmnm^5s^2Uとその誘導体である5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン(mnm^5se^2U)の生合成に関与するシステインデスルフラーゼとセレノリン酸シンテターゼ、tRNA硫黄転移酵素(MnmA)の機能解析を目的とした。(1)2-チオ化活性未修飾tRNA^<Lys>を、IscS、野生型および変異型MnmA、[^<35>S]-L-システイン、MgATP、ジチオスレイトール(DTT)とともにインキュベーションし、ホスフォイメージャーを用いて^<35>Sで標識されたtRNAを検出した。その結果、D17A、C102A、C199Aを用いた反応では^<35>S標識tRNAは生成されず、Asp17、Cys102、Cys199がMnmAの酵素活性にとって重要な残基であることが明らかとなった。(2)IscSからMnmAへの硫黄転移反応^<35>S標識ペルスルフィド型IscSを野生型および変異型MnmAとインキュベーションし、PAGEで分離後、ホスフォイメージャーを用いて^<35>S標識MnmAを検出した。その結果、野生型酵素およびC199Aと比較して、C102Aに転移した硫黄の量は著しく少ないことが明らかとなった。この結果より、Cys102がペルスルフィド型IscSから硫黄を受け取る残基であると考えられた。(3)AMP生成反応本酵素反応により生成するATP分解産物を、HPLCを用いて分析した。野生型MnmAをMgATPのみとインキュベーションした場合と比べて、この反応液にtRNA、IscS、L-システインを添加した場合にAMPの生成量が著しく増加した。このことは、本酵素反応において、tRNAがアデニル化される可能性を示唆している。以上の結果より、以下のような反応機構が考えられた。ペルスルフィド型IscSの硫黄はMnmAのCys102に転移する。一方で、MnmAはATPを用いてtRNAの34番目のウリジンの2位の酸素をアデニル化により活性化する。Cys102上のペルスルフィドの硫黄、または遊離した硫黄がピリミジン環の2位炭素を求核攻撃してAMPが遊離し、最終的にs^2Uが生成する。

5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷 (mnm^5s^2U) 是 tRNA 的修饰碱基，特异性存在于 tRNA 反密码子的摆动碱基处，对于氨酰化和核糖体上的高效翻译发挥重要作用。本研究中，我们研究了半胱氨酸脱硫酶、硒磷酸合成酶、tRNA硫转移酶（目的是分析MnMA的功能）。 (1) 将 2-硫醇化活性未修饰 tRNA^<Lys> 与 IscS、野生型和突变型 MnMA、[^35S]-L-半胱氨酸、MgATP 和二硫苏糖醇 (DTT)（^35S 标记）一起孵育使用磷光成像仪检测 tRNA。结果，在使用D17A、C102A和C199A的反应中没有产生35S-标记的tRNA，表明Asp17、Cys102和Cys199是MnMA酶活性的重要残基。 (2)从IscS到MnmA的硫转移反应将35S标记的过硫化物IscS与野生型和突变型MnmA一起温育，通过PAGE分离，然后使用磷光成像仪检测分离35S标记的MnMA。。结果显示，转移至C102A的硫量显着低于野生型酶和C199A。根据该结果，认为Cys102是从过硫化物型IscS接收硫的残渣。 (3)AMP生成反应使用HPLC分析由该酶反应生成的ATP分解产物。当向该反应溶液中添加 tRNA、IscS 和 L-半胱氨酸时，与野生型 MnMA 单独与 MgATP 孵育时相比，产生的 AMP 量显着增加。这表明 tRNA 可能在该酶促反应中被腺苷酸化。基于以上结果，考虑以下反应机理。过硫化物IscS的硫转移到MnMA的Cys102上。另一方面，MnMA利用ATP通过腺苷酸化激活tRNA 34位尿苷2位上的氧。 Cys102上的过硫化物的硫或游离硫以亲核方式攻击嘧啶环的2位碳，释放出AMP并最终产生s^2U。