吸血性ダニ由来新規接触相阻害物質に関する研究

新型吸血螨接触相抑制剂的研究

基本信息

批准号：
15780073
负责人：
岩永史朗
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15780073/
关键词：
吸血性ダニ接触相高分子キニノゲン血液凝固第XII因子

项目摘要

現在までに申請者はフタトゲチマダニより新規接触相阻害物質を同定し、これが高分子キニノゲン及び血液凝固第XII因子と結合し、両接触相因子が異物表面と結合するのを阻害して、接触相の活性化を阻害することを明らかとしている。平成15年度は更に接触相阻害物質が持つ2つのKunitz型タンパク質ドメイン(N-domain及びC-domainと表記)に着目し、1)N-及びC-domainともに接触相活性化阻害に関与すること、2)C-domainが接触相活性化をN-domainより強く阻害すること、3)C-domainが高分子キニノゲンの異物結合部位に特異的に結合することを明らかとした。また、接触相阻害物質単独の結晶化を試み、3種の結晶を得た。平成16年度は接触相阻害物質に関する各種変異体を作製し、阻害に必須なアミノ酸残基の同定を試みた。その結果、N-domain中ではTrp29,Leu30,Tyr31,Tyr43,Glu56,Glu60,C-domain中ではTyr85,Va186,Tyr87,Va197,Phe113,Glu117が阻害に深く関与することを明らかとした。次に接触相阻害物質の立体構造解明を試みた。平成15年度に得た3種の結晶に関し、X線結晶解析を試みたが、良好な結果を得ることができなかった。そこで、接触相阻害物質がKunitz型タンパク質であることを利用し、Molecular Operating Enviromentによる分子構造予測モデルを作製した。更に得られたモデルと変異体の実験結果を合せて考察すると、阻害に関与するアミノ酸は阻害分子表面上の一部に集中して存在することが示唆された。これにより、この接触相阻害分子はこの領域を使って標的分子と相互作用すると推定した。

迄今为止，申请人已经从菲利斯蜱中鉴定出一种新型接触相抑制剂，其与聚合激肽原和凝血因子结合，并已显示出抑制激活。 2003年，我们进一步关注接触相抑制剂所具有的两个Kunitz型蛋白结构域（记为N结构域和C结构域），发现1）N结构域和C结构域均参与接触相激活抑制；，2) C 结构域比 N 结构域更强烈地抑制接触相激活，并且 3) C 结构域特异性结合聚合激肽原的外来物质结合位点。我们还尝试单独结晶接触相抑制剂并获得三种类型的晶体。 2004年，我们创建了接触相抑制剂的各种突变体，并试图鉴定抑制所必需的氨基酸残基。结果显示，N 结构域中的 Trp29、Leu30、Tyr31、Tyr43、Glu56、Glu60 和 C 结构域中的 Tyr85、Va186、Tyr87、Va197、Phe113 和 Glu117 深度参与抑制。接下来，我们试图阐明接触相抑制剂的三维结构。我们尝试对2003年获得的三种晶体进行X射线晶体分析，但未能获得良好的结果。因此，我们利用分子操作环境创建了分子结构预测模型，利用接触相抑制剂是库尼茨型蛋白质的事实。此外，当将获得的模型和突变体的实验结果结合起来考虑时，表明参与抑制的氨基酸集中在抑制分子表面的一部分上。由此，我们推断该接触相抑制分子利用该区域与目标分子相互作用。