2-オキソ酸関連酸化還元酵素群の立体構造と代謝系進化の構造ゲノム科学

2-含氧酸相关氧化还原酶三维结构的结构基因组科学和代谢系统的进化

• 批准号: 15770072
• 负责人: 角田 大
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: Showa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15770072/
• 关键词: 結晶構造解析; 古細菌酵素; 2-オキソ酸

解糖経路の最後に合成されるピルビン酸や、クエン酸回路中で形成される2-オキソ酸はエネルギー産生系における必須の代謝物質である。これらの代謝反応に関わる酵素群の構造は真核生物と真正細菌では類似しているが、古細菌では全く異なる。また古細菌には超好熱菌などの極限環境に適応したものも多く、工業的利用価値も高いと期待されている。さらに好熱菌酵素の分子認識に関しては、特異な性質を有し幅広い基質選択性をもつ例が知られ、これらの酵素の構造・機能の研究は、酵素の基礎的理解の上からも、応用という面からも重要である。本研究では、既に全ゲノム配列が明らかになっている好酸性好熱古細菌Sulfolobus tokodaiiと好気性超好熱古細菌Aeropyrum pernix由来の2-オキソ酸関連酸化還元酵素及び代謝に関連する酵素を、X線解析により立体構造を明らかにし、真核生物や真正細菌の酵素との構造・反応機構を比較することで、代謝系の進化的な側面を探ってきた。古細菌Sulfolobus tokodaii strain 7及び古細菌Aeropyrum pernix K1由来の代謝酵素の蛋白質発現用プラスミドを大腸菌株に形質転換し、多量に発現する培養条件を検討した。カラムクロマトを用いて、結晶化に適したサンプルの高純度精製を行った。21種類について精製が完了し、得られたサンプルについては、蒸気拡散法で市販のスクリーニングキットを用いて広範囲に結晶化を行った。結晶化にはハイスループットな手法を取り入れた効率の良い結晶化法を開発した。結晶化条件をさらに最適化し、X線回折に適した結晶化条件を得て放射光実験を行い、回折データを収集し、分子モデルの構築・原子座標の精密化を行った。タンパク質の立体構造をデータベース、プロテインデータバンクに登録した。

在糖酵解途径末端合成的丙酮酸和在柠檬酸循环过程中形成的2-含氧酸是能量生产系统中的重要代谢物。参与这些代谢反应的酶的结构在真核生物和真细菌中相似，但在古细菌中完全不同。此外，许多古细菌，例如嗜热菌，适应极端环境，预计具有很高的工业价值。此外，关于嗜热酶的分子识别，已知具有独特性质和广泛底物选择性的例子，并且对这些酶的结构和功能的研究不仅对于酶的基本理解而且对于应用应用都很重要。从这个角度来看也很重要。在这项研究中，我们研究了嗜酸嗜热古菌 Sulfolobus tokodaii 和需氧超嗜热古菌 Aeropyrum pernix 的 2-含氧酸相关氧化还原酶和代谢相关酶，我们已经揭示了它们的整个基因组序列。通过 X 射线分析阐明代谢系统的三维结构，并将其结构和反应机制与真核生物和真细菌的酶进行比较。将源自古菌Sulfolobus tokodaii 7号菌株和古菌Aeropyrum pernix K1的代谢酶蛋白表达的质粒转化到大肠杆菌菌株中，并研究了高表达的培养条件。使用柱色谱法，将适合结晶的样品纯化至高纯度。完成21种的精制，使用市售的筛选试剂盒利用蒸气扩散法对所得样品进行广泛结晶化。我们开发了一种有效的结晶方法，该方法结合了高通量结晶方法。我们进一步优化结晶条件，获得适合X射线衍射的结晶条件，进行同步辐射实验，收集衍射数据，构建分子模型并细化原子坐标。蛋白质的三维结构被登记在数据库蛋白质数据库中。