2-オキソ酸関連酸化還元酵素群の立体構造と代謝系進化の構造ゲノム科学

2-含氧酸相关氧化还原酶三维结构的结构基因组科学和代谢系统的进化

• 批准号: 15770072
• 负责人: 角田 大
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: Showa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15770072/
• 关键词: 結晶構造解析; 古細菌酵素; 2-オキソ酸

解糖経路の最後に合成されるピルビン酸や、クエン酸回路中で形成される2-オキソ酸はエネルギー産生系における必須の代謝物質である。これらの代謝反応に関わる酵素群の構造は真核生物と真正細菌では類似しているが、古細菌では全く異なる。また古細菌には超好熱菌などの極限環境に適応したものも多く、工業的利用価値も高いと期待されている。さらに好熱菌酵素の分子認識に関しては、特異な性質を有し幅広い基質選択性をもつ例が知られ、これらの酵素の構造・機能の研究は、酵素の基礎的理解の上からも、応用という面からも重要である。本研究では、既に全ゲノム配列が明らかになっている好酸性好熱古細菌Sulfolobus tokodaiiと好気性超好熱古細菌Aeropyrum pernix由来の2-オキソ酸関連酸化還元酵素及び代謝に関連する酵素を、X線解析により立体構造を明らかにし、真核生物や真正細菌の酵素との構造・反応機構を比較することで、代謝系の進化的な側面を探ってきた。古細菌Sulfolobus tokodaii strain 7及び古細菌Aeropyrum pernix K1由来の代謝酵素の蛋白質発現用プラスミドを大腸菌株に形質転換し、多量に発現する培養条件を検討した。カラムクロマトを用いて、結晶化に適したサンプルの高純度精製を行った。21種類について精製が完了し、得られたサンプルについては、蒸気拡散法で市販のスクリーニングキットを用いて広範囲に結晶化を行った。結晶化にはハイスループットな手法を取り入れた効率の良い結晶化法を開発した。結晶化条件をさらに最適化し、X線回折に適した結晶化条件を得て放射光実験を行い、回折データを収集し、分子モデルの構築・原子座標の精密化を行った。タンパク質の立体構造をデータベース、プロテインデータバンクに登録した。

丙酮酸是在糖酵解途径末端合成的，在柠檬酸周期中形成的2-氧化物是能量生产系统中必不可少的代谢物。这些代谢反应涉及的酶的结构在真核生物和真菌中相似，但古细菌却完全不同。此外，许多古细菌都适用于极端环境，例如高疗细菌，预计将具有高工业用途。此外，对于嗜热酶的分子识别，已知的示例具有独特的特性和广泛的底物选择性，并且从对酶的基本理解和应用的角度来看，对这些酶的结构和功能的研究很重要。在这项研究中，我们通过X射线射线分析来自有氧性高疗法的2-氧化物相关氧化还原酶的X射线分析探索了代谢系统的进化方面高疗法pernix pernix，并通过将结构和反应机理与真核生物和真菌酶进行比较。表达源自源自弓形硫sulobolus tokodaii菌株的代谢酶蛋白质的质粒和弓形幼虫pernix k1的质粒转化为大肠杆菌菌株，并检查了大量培养条件。使用柱色谱法进行了适合结晶的样品的高纯度纯化。使用蒸气扩散方法，使用市售筛选套件在较宽的范围内完成了21种类型的纯化，并在较宽的范围内结晶了纯化。我们已经开发了一种有效的结晶方法，该方法结合了一种用于结晶的高通量方法。进一步优化了结晶条件，并适当地获得了X射线衍射的同步条件，并收集了衍射数据，构建了分子模型并完善了原子坐标。蛋白质的三维结构在数据库和蛋白质数据库中注册。